研究背景和目的肝癌是世界范围内发病率和死亡率都在不断增加的几种少数实体瘤之一,是肿瘤相关疾病导致死亡的第二大恶性肿瘤。肝细胞型肝癌是原发性肝癌的主要类型,其具有很强的表型和分子异质性。肝内转移及微卫星病灶的形成是肝癌复发和转移的主要形式,肝内血窦、小胆管分布密集为肝癌的肝内播散提供了有利条件。作为机体最大的消化器官和代谢器官,肝脏具有强大的再生功能,已经明确证实的肝内干细胞、星状细胞、成熟的肝细胞以及外源性的间充质干细胞都可参与肝脏的损伤修复,协同肝组织的再生,理论上每一群可再生的细胞都有可能在损伤修复的过程中发生错配,形成肝癌的最初起源,这造成了肝癌起源的多重可能。起源的复杂性进一步导致了肝癌内部的异质性,具有异质性的肿瘤细胞之间以及肿瘤细胞与正常细胞之间的信号传导错综复杂,在肿瘤发生发展的过程中相互依赖相互促进,对肝癌的临床治疗形成了严峻的考验。混合型肝癌作为肝癌的一种特有类型,以发病人群低、肿瘤恶性度高、成分构成复杂为其主要特征,受限于现有的临床诊断的方式与病理学诊断指标,对这种类型肝癌的临床诊疗就变得更加困难。基于肝癌的研究现状,本课题希望从以下几个方面寻求肝癌研究领域的突破,旨在通过临床-基础-临床间的相互转化,为肝癌的临床诊疗提供新的思路:借助对肿瘤细胞间物质及信号传递的重要介质——外泌体的相关研究,揭示肝癌内部不同肿瘤细胞之间交互作用的新机制;利用基因组及外显子测序分析在单细胞水平对肝癌的起源进行探究,确定肿瘤干细胞在肝癌发生发展及肿瘤复发过程中的作用;希望通过基因组学的相关研究寻找到辅助肝癌临床评估的新指标;通过基因组和外显子组的数据分析希望可以在一定程度上对肝癌的临床亚型——混合型肝癌的高频突变基因及特异性驱动基因进行揭示,为临床诊疗提供潜在的诊断指标和治疗靶点。研究方法和结果研究方法1.超速离心法制备纯化肿瘤细胞外泌体,并通过电镜扫描、外泌体染色、蛋白定量分析及mi RNA定量分析,对肝癌细胞外泌体进行多重表征。2.通过肝癌细胞外泌体与正常肝细胞共培养,利用RT-PCR对调控DNA损伤修复的84个关键酶活性进行检测,明确肝癌细胞外泌体对正常受体细胞DNA损伤修复的调控作用。3.利用划痕实验、趋化实验、侵袭实验及克隆形成实验探究肝癌细胞相关外泌体对肿瘤细胞侵袭和转移的调控作用。4.构建经放疗致死剂量照射后进行异体骨髓移植的小鼠模型,并在建立此模型的基础上诱导小鼠原发肝癌的产生,探究肝癌的起源。5.利用流式分选技术对新鲜肝癌组织样本中的肿瘤干细胞及非干肿瘤细胞进行分离,体外验证干细胞生物学特征的同时利用单细胞全基因组测序技术分析肿瘤干细胞及非干肿瘤细胞的基因拷贝变异,绘制肿瘤进化模型,探讨肝癌干细胞在肝癌发生发展过程中的作用。6.通过对比不同临床特点肝癌患者(初发肝癌和复发肝癌)的肿瘤进化模型,探究肿瘤干细胞在肿瘤复发过程中的作用;通过对比不同恶性程度肝癌患者(有血管侵犯和无血管侵犯)的基因拷贝变异程度的差异,探讨肝癌基因拷贝变异程度对肝癌恶性程度的评价作用。7.通过对混合型肝癌临床新鲜冰冻样本的全基因组和外显子测序,分析其拷贝数变异及单核苷酸变异,进而探究混合型肝癌的高频突变基因及特异性突变基因,辅助混合型肝癌的临床诊断及治疗。8.通过单细胞全基因组测序分析及单细胞突变验证,揭示混合型肝癌的肿瘤异质性,探究其可能存在的克隆起源。结果1.Rab27a可以调控肝癌细胞外泌体的分泌,其表达强度与肝癌患者的肝硬化程度、血清AFP水平以及血管侵犯呈正相关。2.肝癌细胞相关外泌体可以影响正常肝细胞的DNA损伤修复,使得正常肝细胞发生恶性转化。3.肝癌细胞分泌的外泌体可以促进受体肿瘤细胞的体外运动、趋化、侵袭以及克隆形成能力;体内研究结果证实肝癌细胞相关外泌体可以促进肝癌细胞的肝内播散和肝外转移,与肝癌的术后复发密切相关。4.经放疗致死剂量照射并进行异体骨髓移植的小鼠原发肝癌模型揭示骨髓间充质干细胞参与肝脏损伤后的修复,并作为肝癌重要的克隆起源参与肝癌的发生与发展。5.单细胞全基因组基因拷贝变异分析结果揭示肝癌干细胞贯穿肝癌发生发展的始终并与肝癌的术后复发密切相关。6.肝癌组织内部存在一定的异质性,从单细胞水平揭示肝癌的基因拷贝变异的复杂性可能有助于判断肝癌的恶性程度。7.TP53在混合型肝癌患者中的突变频率显著高于肝细胞肝癌和胆管细胞型肝癌,可作为辅助混合型肝癌诊断的潜在指标之一。8.混合型肝癌存在特有的高频突变基因,包括FSIP2,PKHD1L1,SVEP1,LRP1B,这是在以往肝癌测序相关研究中从未被报道的,对这些高频基因进行深入的揭示可能有助于了解混合型肝癌的发生并可作为潜在的临床诊断指标或治疗靶点。9.单细胞水平对混合型肝癌进行全基因组拷贝数变异分析及单核苷酸变异验证揭示了混合型肝癌内部的异质性以及具有肝细胞表型的肿瘤细胞和具有胆管细胞表型的肿瘤细胞具有相同的起源。结论1.Rab27a可作为预测肝癌患者肝硬化程度及血管侵犯的潜在指标;肝癌细胞分泌的外泌体被受体细胞摄取后一方面会促进其发生EMT,进而增强其迁移、侵袭的能力,另一方面会影响受体细胞的DNA损伤修复进程,进而促进正常细胞的恶性转化;体内实验结果表明肝癌细胞分泌的外泌体还可以促进肝癌细胞的肝内转移及肝外播散。2.骨髓间充质干细胞在肝脏损伤的情况下会进入肝脏参与肝修复和再生,并在一定环境下可作为肝癌的起源参与肝癌发生发展的全程;抑制骨髓间充质干细胞参与肝脏的损伤修复在一定程度上有助于降低肝癌的发病率(基于本研究所建立的小鼠模型所得到的结论)。3.肝癌干细胞参与肝癌发生发展的全过程并在肝癌复发的过程中起到重要作用;肝癌内部存在一定的异质性,不同的干细胞亚群可能存在不同的调控功能;肝癌细胞拷贝数变异的复杂程度可作为预测肝癌恶性程度的潜在指标。4.混合型肝癌较肝细胞肝癌和胆管细胞型肝癌具有更高的TP53突变频率;混合型肝癌具有不同于其余两种肝癌亚型的特异性突变基因:FSIP2,PKHD1L1,SVEP1,LRP1B;混合型肝癌中向肝细胞分化和向胆管细胞分化的肿瘤细胞具有相同的起源,而不是在发育成熟以后各自发生致癌转化后产生的。