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[摘要] 目的 探讨MicroRNA-22-3p（miR-22-3p）在食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）组织中的表达情况，并分析miR-22-3p与食管鳞状细胞癌临床病理特征、预后之间的关系。 方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应法（qPCR）检测miR-22-3p在77例ESCC组织和癌旁正常组织中的表达差异及其与食管鳞状细胞癌的临床病理特征、预后的相关性。 结果 miR-22-3p不同程度高表达36.4%（28/77），正常表达20.8%（16/77），低表达42.8%（33/77）。miR-22-3p相对高表达的患者无病生存期较非高表达患者长（P<0.05），但miR-22-3p的表达水平与临床病理特征（性别、年龄、肿瘤位置、分化程度、浸润程度、淋巴结转移、TNM分期、肿瘤家族史、吸烟和饮酒）之间均无相关性（P>0.05）。 结论 miR-22-3p在食管癌的发生发展中起着抑癌因子的作用，其高表达能延长食管癌患者的生存时间。
[关键词] miR-22-3p；食管鳞状细胞癌；无病生存期；抑癌因子
[中图分类号] R735.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）27-0001-04
Expression and clinical significance of microRNA-22-3p in esophageal squamous cell carcinoma
WANG Jiangfeng CHEN Sheng LING Zhiqiang
Department of Thoracic Surgery， Zhejiang Cancer Hospital， Hangzhou 310022， China
[Abstract] Objective To explore the expression of MicroRNA-22-3p （miR-22-3p） in esophageal squamous cell carcinoma（ESCC）， and to analyze the relationship of miR-22-3p with clinical pathological characteristics and prognosis of ESCC. Methods Real-time qPCR was applied to test the expression differences of miR-22-3p in 77 cases of ESCC tissues and tumor-adjacent normal tissues， as well as its relevance with the clinical pathological characteristics and prognosis of ESCC. Results High expression of miR-22-3p with different degrees was 36.4%（28/77）， normal expression 20.8%（16/77）， and low expression 42.8%（33/77）. The disease free survival of the patients with relatively high expression of miR-22-3p was longer than the patients without high expression of miR-22-3p（P<0.05）， but the expression level of miR-22-3p was not correlated with clinical pathological characteristics（gender， age， tumor location， degree of differentiation， infiltration degree， lymphatic metastasis， TNM staging， tumor family history， smoking and alcohol drinking）（P>0.05）. Conclusion miR-22-3p plays as a cancer suppressive factor in the occurrence and development of esophageal cancer， and its high expression is able to prolong the survival time of the patients with esophageal cancer.
[Key words] miR-22-3p； Esophageal squamous cell carcinoma （ESCC）； Disease free survival； Cancer suppressive factor
肿瘤是发达国家中最主要的死亡原因，在发展中国家位居第二。食管癌的发病率和死亡率在世界范围内位居第六[1]。鳞状细胞癌和腺癌是食管癌的主要病理类型，鳞状细胞癌主要位于食管中上段，占食管癌的90%；其余少部分为腺癌，一般位于食管下段[2]。食管鳞状细胞癌确诊往往已属晚期，侵袭和转移的患者预后不佳。目前仍未发现食管鳞状细胞癌高度特异性标记物，因此早期诊断食管鳞状细胞癌十分困难[3]。微小RNA（microRNA）是一类22nt左右片段大小的、具有高度组织特异性的非编码RNA，对确诊肿瘤的病理类型和起源具有潜在意义[4]。Real-Time PCR可检测食管鳞状细胞癌患者组织中miR-22-3p的相对表达情况，分析miR-22-3p与食管鳞状细胞癌的病理特征和患者预后之间的关系。本文主要研究miR-22-3p的相对表达情况对食管癌的发生、进展及转移的作用及预测功能，为食管鳞状细胞癌的转移潜能和患者预后评估提供理论依据。现报道如下。 1资料与方法
1.1一般资料
收集77例ESCC组织及癌旁正常组织，病例来自于2008年2月～2009年11月我院食管癌手术后组织标本（病理科明确诊断食管鳞癌），女7例，男70例，年龄46～81岁，平均64.4岁。术前未经任何放化疗，排除自身免疫性疾病及严重感染性疾病。癌旁正常组织取自肿瘤边缘5 cm外区域肉眼下正常食管组织；术后标本立即保存于液氮中，并转移至浙江省肿瘤研究所，提取总RNA，转录cDNA后保存于-80℃冰箱待实验用。组织标本TNM分期和分级：高/中分化55例，低分化22例；Ⅰ/Ⅱ期39例，Ⅲ/Ⅳ期38例；伴淋巴结转移44例，无淋巴结转移33例。本研究经医院伦理委员会审批同意，电话随访患者，随访截止时间设定为2013年3月25日。
1.2 试剂
RNA提取试剂盒为Qiagen公司的MirNeasy Mini Kit，Prime ScriptR miRNA cDNA Synthesis Kit（D350A）反转录试剂盒和SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ（DRR 081A）real-time PCR试剂盒均购于TaKaRa公司。实验引物（上海捷瑞）：miR-22-3p：5’-AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU-3’，U6：5’-CGCTTCGGCAGCACA-TATAC-3。
1.3 实验方法
1.3.1 提取总RNA 肿瘤组织及对应正常组织的总RNA按照MirNeasy Mini Kit试剂盒说明书提取，总RNA的浓度和纯度由紫外分光光度计检测：A260/A 280范围在1.8～2.1间的样本用于后续实验。
1.3.2 转录RNA 将上述提取总RNA（1 μg）按说明书提供的反应条件设置温度，在PCR仪上进行cDNA的逆转录。
1.3.3 cDNA扩增 ABI 7500PCR仪（Applied Biosystems）分析RT-PCR的PCR扩增及溶解曲线。反应体系20 μL，具体操作按SYBRR Premix Ex TaqTM Ⅱ说明书步骤。PCR反应过程：激活聚合酶50 ℃ 2 min，预变性95℃ 30 s；变性95℃ 5 s，退火和延伸60℃ 34 s，40个循环扩增。PCR溶解曲线：95℃ 15 s，60℃ 60 s，85℃ 15 s，60℃ 15 s。设复孔3个取均值计算。按2-△△CT法分析结果：△CT=Ct（miR-22-3p）- Ct（U6）；按△△CT=△CT（癌组织）-△CT（癌旁正常组织）计算miR-22-3p在食管鳞状细胞癌组织和癌旁正常组织中相对表达情况，表达下降：△△CT>1；表达正常：-1≤△△CT≤1；表达升高：△△CT<-1，设定癌旁正常组织miR-22-3p相对平均表达量为1，其余组表达量为2-△△CT计算，最终计算相对改变倍数。将所有样本分为高表达组和非高表达组，将临床病理特征设定为1或者0，并统计各组别例数，χ2检验计算两组别例数是否有统计学差异。电话随访计算各例患者的生存时间（月），根据分组情况采用乘积极限法（Kaplan-Meier）进行单因素生存分析。
1.4 统计学分析
应用SPSS18.0统计软件，计量资料以（x±s）表示，采用单因素ANOVA比较各组表达倍数；计数资料以率表示，采用χ2检验比较各组表达情况和临床病理特征关系；采用乘积极限法（Kaplan-Meier）进行单因素生存分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 miR-22-3p相对表达比较
miR-22-3p在食管鳞状细胞癌组织相对癌旁正常组织高表达28例（36.4%），相对正常表达16例（20.8%），相对低表达33例（42.8%）。设定正常组织miR-22-3p相对平均表达量为1，其中高表达组食管癌的平均表达量为（16.07±5.94），正常组为（0.92±0.36），下降组为（0.13±0.03），高表达组相对表达量与正常组和下降组比较差异有统计学意义（P<0.05）。各组别的样本相对表达倍数见图1。
2.2 miR-22-3p相对表达情况与临床病理特征的关系
miR-22-3p相对表达情况与食管鳞状细胞癌临床病理特征的关系通过χ2检验分析：高表达组和非高表达组中miR-22-3p表达水平与临床病理特征（性别、年龄、肿瘤位置、分化程度、淋巴结转移、浸润程度、肿瘤家族史、TNM分期、吸烟和饮酒）之间均无显著相关性（P>0.05），见表1。
2.3 miR-22-3p表达水平与预后的关系
按miR-22-3p相对表达情况将77例食管鳞癌患者分为高表达组和非高表达组，两组患者的无病生存期采用K-M法分析比较，实验结果显示高表达组相较非高表达组更具有生存优势（r=0.862，P=0.016），见图2。
3 讨论
最近研究[5-8]发现miR-22-3p在前列腺癌中高表达，而在肾细胞癌、乳腺癌、胆管癌和多发性骨髓瘤中低表达，鲜有报道miR-22-3p在食管鳞状细胞癌中的表达情况和临床意义。本研究采用实时定量PCR法检测食管鳞状细胞癌组织中miR-22-3p相对表达情况，分析研究miR-22-3p的相对表达情况对食管癌的发生、进展及转移的作用及预测功能，为食管鳞状细胞癌的转移潜能和患者预后评估提供理论依据。
本研究检测了miR-22-3p在食管鳞癌中的表达情况和临床病理及患者预后的关系，结果表明：在77例食管鳞癌组织标本中，miR-22-3p高表达为28例，正常表达16例，低表达33例。miR-22-3p高表达与临床病理特征之间无相关性（P>0.05），但部分指标如浸润程度和淋巴结转移P值接近0.05，预测 miR-22-3p高表达可能与抑制肿瘤细胞的浸润和淋巴结转移存在一定相关性；miR-22-3p高表达的患者生存时间延长，表明miR-22-3p能改善食管鳞癌患者的预后。 本研究证实miR-22-3p在食管鳞癌中高表达患者的预后较非高表达患者好，两者的差异具有统计学意义，与Zhang等[9]研究miR-22在肝癌中的表达情况和预后等关系结果相一致，同时他们在肝癌细胞中研究还发现miR-22体外抑制肝癌细胞的增殖和转移，其机制可能与miR-22调控HDAC4基因相关。本研究证实miR-22-3p表达水平与临床特征如性别、年龄、肿瘤位置、淋巴结转移、TNM分期、浸润程度、吸烟和饮酒无相关性（P>0.05），与Zhang等[10]研究 miR-22的表达在结直肠癌中的临床意义的结果相一致，miR-22在结直肠癌组织中的表达较正常组织低，miR-22的表达水平和结直肠癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、组织学类型、浸润深度、淋巴结转移、肿瘤的位置和淋巴管浸润不相关（P>0.05）；矛盾的是Zhang等研究发现miR-22的表达水平与肝转移相关（P<0.05），可能与本研究标本量小及标本来源不同有关。
Guo等[11]研究miR-22的表达情况与胃癌关系同样发现：miR-22可能在胃癌的进展中也发挥着重要的作用。同时在细胞层面研究发现，miR-22可能是通过调控Sp1基因来抑制胃癌细胞的转移和浸润。Xu等[12]研究miR-22的表达情况与肿瘤的关系的机制发现：miR-22是一种新型的通过细胞衰老机制调控肿瘤细胞和正常细胞。miR-22在体内外通过促进肿瘤细胞的衰老来阻止肿瘤细胞的进展，miR-22可能主要以SIRT1、Sp1和CDK6基因为靶基因，通过这三个基因的细胞衰老信号通路，最终以p53或pRb通路来抑制肿瘤细胞增殖、浸润和进展。
Fan等[13]研究发现miR-22在肾细胞癌中低表达，但体外细胞实验研究发现：miR-22抑制786-0和A498细胞增殖、转移和浸润。miR-22可能通过作用于PTEN靶基因发挥抑癌基因的作用。在急性髓系白血病研究中，Jiang等[14]发现miR-22在急性髓系白血病中低表达，且发挥着一个潜在抗肿瘤基因作用。miR-22通过调控多个癌基因（CRTC1、FLT3、MYCBP），抑制CREB和MYC通路发挥作用。miR-22在急性髓系白血病中低表达是由TET1/GFI1/EZH2/SIN3A通路抑制和（或）基因组DNA损失。与此同时，纳米粒子携带miR-22寡核苷酸在体内显著抑制白血病进展[15-22]，同时，本文研究揭示TET1/GFI1/EZH2/SIN3A/miR-22/CREB-MYC信号电路，提供了表观遗传/遗传机制，并强调了miR-22在临床上治疗急性髓系白血病的潜力。
本研究结果显示miR-22-3p是一种抑制食管鳞癌发生、进展的小分子RNA，其相对高表达能延长患者的生存时间，且改善预后。本研究初步证实了miR-22-3p的相对表达情况和食管鳞癌预后的相关性，其高表达可能降低食管鳞癌的浸润和淋巴结转移，但细胞机制和分子生物学研究仍需进一步探索。
[参考文献]
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（收稿日期：2016-04-27）
[关键词] miR-22-3p；食管鳞状细胞癌；无病生存期；抑癌因子
[中图分类号] R735.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）27-0001-04
Expression and clinical significance of microRNA-22-3p in esophageal squamous cell carcinoma
WANG Jiangfeng CHEN Sheng LING Zhiqiang
Department of Thoracic Surgery， Zhejiang Cancer Hospital， Hangzhou 310022， China
[Abstract] Objective To explore the expression of MicroRNA-22-3p （miR-22-3p） in esophageal squamous cell carcinoma（ESCC）， and to analyze the relationship of miR-22-3p with clinical pathological characteristics and prognosis of ESCC. Methods Real-time qPCR was applied to test the expression differences of miR-22-3p in 77 cases of ESCC tissues and tumor-adjacent normal tissues， as well as its relevance with the clinical pathological characteristics and prognosis of ESCC. Results High expression of miR-22-3p with different degrees was 36.4%（28/77）， normal expression 20.8%（16/77）， and low expression 42.8%（33/77）. The disease free survival of the patients with relatively high expression of miR-22-3p was longer than the patients without high expression of miR-22-3p（P<0.05）， but the expression level of miR-22-3p was not correlated with clinical pathological characteristics（gender， age， tumor location， degree of differentiation， infiltration degree， lymphatic metastasis， TNM staging， tumor family history， smoking and alcohol drinking）（P>0.05）. Conclusion miR-22-3p plays as a cancer suppressive factor in the occurrence and development of esophageal cancer， and its high expression is able to prolong the survival time of the patients with esophageal cancer.
[Key words] miR-22-3p； Esophageal squamous cell carcinoma （ESCC）； Disease free survival； Cancer suppressive factor
肿瘤是发达国家中最主要的死亡原因，在发展中国家位居第二。食管癌的发病率和死亡率在世界范围内位居第六[1]。鳞状细胞癌和腺癌是食管癌的主要病理类型，鳞状细胞癌主要位于食管中上段，占食管癌的90%；其余少部分为腺癌，一般位于食管下段[2]。食管鳞状细胞癌确诊往往已属晚期，侵袭和转移的患者预后不佳。目前仍未发现食管鳞状细胞癌高度特异性标记物，因此早期诊断食管鳞状细胞癌十分困难[3]。微小RNA（microRNA）是一类22nt左右片段大小的、具有高度组织特异性的非编码RNA，对确诊肿瘤的病理类型和起源具有潜在意义[4]。Real-Time PCR可检测食管鳞状细胞癌患者组织中miR-22-3p的相对表达情况，分析miR-22-3p与食管鳞状细胞癌的病理特征和患者预后之间的关系。本文主要研究miR-22-3p的相对表达情况对食管癌的发生、进展及转移的作用及预测功能，为食管鳞状细胞癌的转移潜能和患者预后评估提供理论依据。现报道如下。 1资料与方法
1.1一般资料
收集77例ESCC组织及癌旁正常组织，病例来自于2008年2月～2009年11月我院食管癌手术后组织标本（病理科明确诊断食管鳞癌），女7例，男70例，年龄46～81岁，平均64.4岁。术前未经任何放化疗，排除自身免疫性疾病及严重感染性疾病。癌旁正常组织取自肿瘤边缘5 cm外区域肉眼下正常食管组织；术后标本立即保存于液氮中，并转移至浙江省肿瘤研究所，提取总RNA，转录cDNA后保存于-80℃冰箱待实验用。组织标本TNM分期和分级：高/中分化55例，低分化22例；Ⅰ/Ⅱ期39例，Ⅲ/Ⅳ期38例；伴淋巴结转移44例，无淋巴结转移33例。本研究经医院伦理委员会审批同意，电话随访患者，随访截止时间设定为2013年3月25日。
1.2 试剂
RNA提取试剂盒为Qiagen公司的MirNeasy Mini Kit，Prime ScriptR miRNA cDNA Synthesis Kit（D350A）反转录试剂盒和SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ（DRR 081A）real-time PCR试剂盒均购于TaKaRa公司。实验引物（上海捷瑞）：miR-22-3p：5’-AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU-3’，U6：5’-CGCTTCGGCAGCACA-TATAC-3。
1.3 实验方法
1.3.1 提取总RNA 肿瘤组织及对应正常组织的总RNA按照MirNeasy Mini Kit试剂盒说明书提取，总RNA的浓度和纯度由紫外分光光度计检测：A260/A 280范围在1.8～2.1间的样本用于后续实验。
1.3.2 转录RNA 将上述提取总RNA（1 μg）按说明书提供的反应条件设置温度，在PCR仪上进行cDNA的逆转录。
1.3.3 cDNA扩增 ABI 7500PCR仪（Applied Biosystems）分析RT-PCR的PCR扩增及溶解曲线。反应体系20 μL，具体操作按SYBRR Premix Ex TaqTM Ⅱ说明书步骤。PCR反应过程：激活聚合酶50 ℃ 2 min，预变性95℃ 30 s；变性95℃ 5 s，退火和延伸60℃ 34 s，40个循环扩增。PCR溶解曲线：95℃ 15 s，60℃ 60 s，85℃ 15 s，60℃ 15 s。设复孔3个取均值计算。按2-△△CT法分析结果：△CT=Ct（miR-22-3p）- Ct（U6）；按△△CT=△CT（癌组织）-△CT（癌旁正常组织）计算miR-22-3p在食管鳞状细胞癌组织和癌旁正常组织中相对表达情况，表达下降：△△CT>1；表达正常：-1≤△△CT≤1；表达升高：△△CT<-1，设定癌旁正常组织miR-22-3p相对平均表达量为1，其余组表达量为2-△△CT计算，最终计算相对改变倍数。将所有样本分为高表达组和非高表达组，将临床病理特征设定为1或者0，并统计各组别例数，χ2检验计算两组别例数是否有统计学差异。电话随访计算各例患者的生存时间（月），根据分组情况采用乘积极限法（Kaplan-Meier）进行单因素生存分析。
1.4 统计学分析
应用SPSS18.0统计软件，计量资料以（x±s）表示，采用单因素ANOVA比较各组表达倍数；计数资料以率表示，采用χ2检验比较各组表达情况和临床病理特征关系；采用乘积极限法（Kaplan-Meier）进行单因素生存分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 miR-22-3p相对表达比较
miR-22-3p在食管鳞状细胞癌组织相对癌旁正常组织高表达28例（36.4%），相对正常表达16例（20.8%），相对低表达33例（42.8%）。设定正常组织miR-22-3p相对平均表达量为1，其中高表达组食管癌的平均表达量为（16.07±5.94），正常组为（0.92±0.36），下降组为（0.13±0.03），高表达组相对表达量与正常组和下降组比较差异有统计学意义（P<0.05）。各组别的样本相对表达倍数见图1。
2.2 miR-22-3p相对表达情况与临床病理特征的关系
miR-22-3p相对表达情况与食管鳞状细胞癌临床病理特征的关系通过χ2检验分析：高表达组和非高表达组中miR-22-3p表达水平与临床病理特征（性别、年龄、肿瘤位置、分化程度、淋巴结转移、浸润程度、肿瘤家族史、TNM分期、吸烟和饮酒）之间均无显著相关性（P>0.05），见表1。
2.3 miR-22-3p表达水平与预后的关系
按miR-22-3p相对表达情况将77例食管鳞癌患者分为高表达组和非高表达组，两组患者的无病生存期采用K-M法分析比较，实验结果显示高表达组相较非高表达组更具有生存优势（r=0.862，P=0.016），见图2。
3 讨论
最近研究[5-8]发现miR-22-3p在前列腺癌中高表达，而在肾细胞癌、乳腺癌、胆管癌和多发性骨髓瘤中低表达，鲜有报道miR-22-3p在食管鳞状细胞癌中的表达情况和临床意义。本研究采用实时定量PCR法检测食管鳞状细胞癌组织中miR-22-3p相对表达情况，分析研究miR-22-3p的相对表达情况对食管癌的发生、进展及转移的作用及预测功能，为食管鳞状细胞癌的转移潜能和患者预后评估提供理论依据。
本研究检测了miR-22-3p在食管鳞癌中的表达情况和临床病理及患者预后的关系，结果表明：在77例食管鳞癌组织标本中，miR-22-3p高表达为28例，正常表达16例，低表达33例。miR-22-3p高表达与临床病理特征之间无相关性（P>0.05），但部分指标如浸润程度和淋巴结转移P值接近0.05，预测 miR-22-3p高表达可能与抑制肿瘤细胞的浸润和淋巴结转移存在一定相关性；miR-22-3p高表达的患者生存时间延长，表明miR-22-3p能改善食管鳞癌患者的预后。 本研究证实miR-22-3p在食管鳞癌中高表达患者的预后较非高表达患者好，两者的差异具有统计学意义，与Zhang等[9]研究miR-22在肝癌中的表达情况和预后等关系结果相一致，同时他们在肝癌细胞中研究还发现miR-22体外抑制肝癌细胞的增殖和转移，其机制可能与miR-22调控HDAC4基因相关。本研究证实miR-22-3p表达水平与临床特征如性别、年龄、肿瘤位置、淋巴结转移、TNM分期、浸润程度、吸烟和饮酒无相关性（P>0.05），与Zhang等[10]研究 miR-22的表达在结直肠癌中的临床意义的结果相一致，miR-22在结直肠癌组织中的表达较正常组织低，miR-22的表达水平和结直肠癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、组织学类型、浸润深度、淋巴结转移、肿瘤的位置和淋巴管浸润不相关（P>0.05）；矛盾的是Zhang等研究发现miR-22的表达水平与肝转移相关（P<0.05），可能与本研究标本量小及标本来源不同有关。
Guo等[11]研究miR-22的表达情况与胃癌关系同样发现：miR-22可能在胃癌的进展中也发挥着重要的作用。同时在细胞层面研究发现，miR-22可能是通过调控Sp1基因来抑制胃癌细胞的转移和浸润。Xu等[12]研究miR-22的表达情况与肿瘤的关系的机制发现：miR-22是一种新型的通过细胞衰老机制调控肿瘤细胞和正常细胞。miR-22在体内外通过促进肿瘤细胞的衰老来阻止肿瘤细胞的进展，miR-22可能主要以SIRT1、Sp1和CDK6基因为靶基因，通过这三个基因的细胞衰老信号通路，最终以p53或pRb通路来抑制肿瘤细胞增殖、浸润和进展。
Fan等[13]研究发现miR-22在肾细胞癌中低表达，但体外细胞实验研究发现：miR-22抑制786-0和A498细胞增殖、转移和浸润。miR-22可能通过作用于PTEN靶基因发挥抑癌基因的作用。在急性髓系白血病研究中，Jiang等[14]发现miR-22在急性髓系白血病中低表达，且发挥着一个潜在抗肿瘤基因作用。miR-22通过调控多个癌基因（CRTC1、FLT3、MYCBP），抑制CREB和MYC通路发挥作用。miR-22在急性髓系白血病中低表达是由TET1/GFI1/EZH2/SIN3A通路抑制和（或）基因组DNA损失。与此同时，纳米粒子携带miR-22寡核苷酸在体内显著抑制白血病进展[15-22]，同时，本文研究揭示TET1/GFI1/EZH2/SIN3A/miR-22/CREB-MYC信号电路，提供了表观遗传/遗传机制，并强调了miR-22在临床上治疗急性髓系白血病的潜力。
本研究结果显示miR-22-3p是一种抑制食管鳞癌发生、进展的小分子RNA，其相对高表达能延长患者的生存时间，且改善预后。本研究初步证实了miR-22-3p的相对表达情况和食管鳞癌预后的相关性，其高表达可能降低食管鳞癌的浸润和淋巴结转移，但细胞机制和分子生物学研究仍需进一步探索。
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（收稿日期：2016-04-27）