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摘 要：目的：旨在探讨葛根素注射液对血管性痴呆小鼠皮层、海马神经元的保护作用。方法：通过采用改良的双侧颈总动脉持久性结扎法制作血管性痴呆模型，从形态学上观察葛根素对血管性痴呆小鼠皮层、海马神经元的保护作用。结果：（1）跳台试验结果提示，葛根素注射液组小鼠的反应时间明显缩短，潜伏期显著延长，错误次数减少。（2）HE染色结果显示，与假手术组相比，模型组小鼠皮层、海马神经元细胞排列紊乱，数目减少，周围有小胶质细胞和星形胶质细胞增生，形态异常，许多细胞出现体积缩小，出现核溶解、固缩、破裂等。与模型组相比，葛根素注射液组小鼠海马、皮层神经元细胞形态异常、损伤的情况明显减轻。结论：葛根素注射液对血管性痴呆小鼠皮层、海马神经元发挥一定的神经保护作用。
关键词：葛根素 血管性痴呆 皮层神经元
中图分类号：R285 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2014）02（a）-0221-02
血管性痴呆（vascular dementia，VD）是继阿尔茨海默病之后第二位最常见的痴呆症，是指大脑功能衰退，特別是与智能有关的功能全面衰退，致其发生的主要原因是脑血流量减少，引起脑组织生化代谢障碍[1]。葛根素（Puerarin，Pur）化学名为4，7一二羟基-8-D葡萄糖基异黄酮，近年来被广泛用于心脑血管疾病等急性期的治疗，包括心绞痛、心肌梗塞，心律失常、脑缺血等[2]。本实验从行为学、形态学角度，观察葛根素注射液对血管性痴呆小鼠皮层、海马神经元的保护作用。
1 材料和方法
1.1 血管性痴呆模型建立
成年昆明小鼠，18～22 g，雌雄不限，购自齐齐哈尔医学院动物研究中心。采用双侧颈总动脉持久性结扎法，并对该方法进行改良。用0.5%戊巴比妥钠麻醉并固定小鼠，钝性分离暴露右侧颈总动脉，结扎右侧颈总动脉，术后给予青霉素2万U/天，4d；于术后7 d进行第二次手术，同法结扎另一侧颈总动脉，腹腔注射青霉素2万U/天，4d，于二次手术后7 d采用跳台试验鉴别血管性痴呆动物模型是否成功建立。
1.2 动物分组
模型建立后小鼠随机分为（1）假手术组；（2）模型组；（3）葛根素组。各组立即给予相应药物。正常组和模型组：腹腔注射生理盐水，1次/日，注射14d。葛根素组：腹腔注射葛根素注射液（1 mg/mL），0.1 mL/10 g，1次/日，注射14d。
1.3 HE染色
在末次给药后1h后取材，各组小鼠脑组织在4%多聚甲醛固定液中固定12 h后，室温梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，常规切片，将组织附于用防脱剂处理过的载玻片上，60 ℃恒温烘箱烘片12 h，备用于HE染色。石蜡切片经二甲苯逐级脱蜡水化后，入苏木素染色液中10 min，盐酸酒精分化数秒后入伊红染色1 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。光镜下观察皮层、海马组织结构变化。
2 结果
2.1 行为学观察
本实验采用跳台试验鉴别血管性痴呆动物模型是否成功建立，跳台实验结果提示，模型组小鼠存在着明显的学习记忆障碍，模型建立成功。与模型组比较，葛根素注射液组小鼠的反应时间明显缩短，潜伏期显著延长，错误次数减少，改善了血管性痴呆小鼠学习记忆能力。
2.2 HE染色
光镜下，假手术组小鼠皮层、海马神经元染色清晰，排列规则整齐，形态完整，多呈锥形、星形，核大而圆，着色较浅，位于细胞中央，偶尔可见嗜酸性核仁。模型组皮层、海马神经细胞排列紊乱，数目减少，周围有三角形或扁圆形小胶质细胞和星形胶质细胞增生，染成红色，形态异常，许多细胞出现体积缩小，核浓染，出现核溶解、固缩、破裂等。葛根素注射液治疗组与模型组相比较，海马、皮层神经元细胞形态异常、损伤的情况明显减轻。见图1。
3 结语
建立理想的VD动物模型对于探明VD的发病机制，开发防治血管性痴呆的新药有着重要意义。双侧颈总动脉永久性结扎模型是血管性痴呆研究中常用的模型之一。传统方法因同时永久性结扎双侧颈总动脉，对动物打击过大，导致动物死亡率高，标本获取困难，实验周期延长。有文献报道报道，传统2VO法动物存活率仅为12.5%，本实验对传统方法进行改良，先后分次结扎双侧颈总动脉，分次结扎，有利于脑部血流重新分配，脑部血供重新建立，机体逐渐代偿适应。同时，更接近临床上常见的脑部慢性缺血的病理过程。实际观察也发现，改良模型组小鼠术后苏醒较快，死亡率也明显减少。
葛根素注射液是由从豆科植物野葛以及甘葛藤的干燥根中提取的有效成分而制成的注射液。临床应用，发现葛根素能明显降低脑梗死患者的梗死灶面积，降低急性脑梗死患者的血流变和提高神经功能学评分，明显改善红细胞变形能力，降低血液粘滞度，改善微循环，增加脑灌注，从而改善VD患者的认知功能[3]。许多脑结构都参与学习和记忆，无论是大脑皮层的不同区，还是海马，都不是独特的学习中枢或记忆中枢，对于不同模式的学习记忆过程发挥关键作用的脑结构不同。海马在简单空间定向和分辨学习与记忆中起着重要作用；前额叶皮层在复杂精细的时间、空间因素的综合学习和记忆过程中最为重要。本研究采用HE染色方法，在光镜下观察到VD模型小鼠皮层、海马区神经数目明显减少，排列紊乱，周围有三角形或扁圆形小胶质细胞和星形胶质细胞增生，染成红色，形态异常。提示永久性脑缺血VD模型小鼠皮层、海马区锥体细胞减少，而幸存的锥体细胞结构破坏不足以代偿其病理损伤而出现功能障碍，可能是其智能障碍的机制之一。葛根素注射液组小鼠跳台试验数据以及皮层、海马区锥体细胞的形态及损伤情况均得到了一定程度的改善，提示葛根素注射液对血管性痴呆小鼠的皮层、海马神经元存在一定的保护作用，但具体保护机制尚有待进一步研究。
参考文献
[1] 李梨，周岐新，石京山.血管性痴呆研究概况[J].中国老年学杂志，2005，25（10）：1269-1271.
[2] 赵坤英，解恒革.葛根总黄酮及葛根素对神经系统保护作用的研究进展[J].中国医药科学，2011，1（1）：65-67.
[3] 常明则，王新来，吴海琴，等.葛根素对血管性痴呆大鼠行为学及额叶细胞凋亡的影响[J].卒中与神经疾病，2009，16（3）：151-154.
关键词：葛根素 血管性痴呆 皮层神经元
中图分类号：R285 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2014）02（a）-0221-02
血管性痴呆（vascular dementia，VD）是继阿尔茨海默病之后第二位最常见的痴呆症，是指大脑功能衰退，特別是与智能有关的功能全面衰退，致其发生的主要原因是脑血流量减少，引起脑组织生化代谢障碍[1]。葛根素（Puerarin，Pur）化学名为4，7一二羟基-8-D葡萄糖基异黄酮，近年来被广泛用于心脑血管疾病等急性期的治疗，包括心绞痛、心肌梗塞，心律失常、脑缺血等[2]。本实验从行为学、形态学角度，观察葛根素注射液对血管性痴呆小鼠皮层、海马神经元的保护作用。
1 材料和方法
1.1 血管性痴呆模型建立
成年昆明小鼠，18～22 g，雌雄不限，购自齐齐哈尔医学院动物研究中心。采用双侧颈总动脉持久性结扎法，并对该方法进行改良。用0.5%戊巴比妥钠麻醉并固定小鼠，钝性分离暴露右侧颈总动脉，结扎右侧颈总动脉，术后给予青霉素2万U/天，4d；于术后7 d进行第二次手术，同法结扎另一侧颈总动脉，腹腔注射青霉素2万U/天，4d，于二次手术后7 d采用跳台试验鉴别血管性痴呆动物模型是否成功建立。
1.2 动物分组
模型建立后小鼠随机分为（1）假手术组；（2）模型组；（3）葛根素组。各组立即给予相应药物。正常组和模型组：腹腔注射生理盐水，1次/日，注射14d。葛根素组：腹腔注射葛根素注射液（1 mg/mL），0.1 mL/10 g，1次/日，注射14d。
1.3 HE染色
在末次给药后1h后取材，各组小鼠脑组织在4%多聚甲醛固定液中固定12 h后，室温梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，常规切片，将组织附于用防脱剂处理过的载玻片上，60 ℃恒温烘箱烘片12 h，备用于HE染色。石蜡切片经二甲苯逐级脱蜡水化后，入苏木素染色液中10 min，盐酸酒精分化数秒后入伊红染色1 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。光镜下观察皮层、海马组织结构变化。
2 结果
2.1 行为学观察
本实验采用跳台试验鉴别血管性痴呆动物模型是否成功建立，跳台实验结果提示，模型组小鼠存在着明显的学习记忆障碍，模型建立成功。与模型组比较，葛根素注射液组小鼠的反应时间明显缩短，潜伏期显著延长，错误次数减少，改善了血管性痴呆小鼠学习记忆能力。
2.2 HE染色
光镜下，假手术组小鼠皮层、海马神经元染色清晰，排列规则整齐，形态完整，多呈锥形、星形，核大而圆，着色较浅，位于细胞中央，偶尔可见嗜酸性核仁。模型组皮层、海马神经细胞排列紊乱，数目减少，周围有三角形或扁圆形小胶质细胞和星形胶质细胞增生，染成红色，形态异常，许多细胞出现体积缩小，核浓染，出现核溶解、固缩、破裂等。葛根素注射液治疗组与模型组相比较，海马、皮层神经元细胞形态异常、损伤的情况明显减轻。见图1。
3 结语
建立理想的VD动物模型对于探明VD的发病机制，开发防治血管性痴呆的新药有着重要意义。双侧颈总动脉永久性结扎模型是血管性痴呆研究中常用的模型之一。传统方法因同时永久性结扎双侧颈总动脉，对动物打击过大，导致动物死亡率高，标本获取困难，实验周期延长。有文献报道报道，传统2VO法动物存活率仅为12.5%，本实验对传统方法进行改良，先后分次结扎双侧颈总动脉，分次结扎，有利于脑部血流重新分配，脑部血供重新建立，机体逐渐代偿适应。同时，更接近临床上常见的脑部慢性缺血的病理过程。实际观察也发现，改良模型组小鼠术后苏醒较快，死亡率也明显减少。
葛根素注射液是由从豆科植物野葛以及甘葛藤的干燥根中提取的有效成分而制成的注射液。临床应用，发现葛根素能明显降低脑梗死患者的梗死灶面积，降低急性脑梗死患者的血流变和提高神经功能学评分，明显改善红细胞变形能力，降低血液粘滞度，改善微循环，增加脑灌注，从而改善VD患者的认知功能[3]。许多脑结构都参与学习和记忆，无论是大脑皮层的不同区，还是海马，都不是独特的学习中枢或记忆中枢，对于不同模式的学习记忆过程发挥关键作用的脑结构不同。海马在简单空间定向和分辨学习与记忆中起着重要作用；前额叶皮层在复杂精细的时间、空间因素的综合学习和记忆过程中最为重要。本研究采用HE染色方法，在光镜下观察到VD模型小鼠皮层、海马区神经数目明显减少，排列紊乱，周围有三角形或扁圆形小胶质细胞和星形胶质细胞增生，染成红色，形态异常。提示永久性脑缺血VD模型小鼠皮层、海马区锥体细胞减少，而幸存的锥体细胞结构破坏不足以代偿其病理损伤而出现功能障碍，可能是其智能障碍的机制之一。葛根素注射液组小鼠跳台试验数据以及皮层、海马区锥体细胞的形态及损伤情况均得到了一定程度的改善，提示葛根素注射液对血管性痴呆小鼠的皮层、海马神经元存在一定的保护作用，但具体保护机制尚有待进一步研究。
参考文献
[1] 李梨，周岐新，石京山.血管性痴呆研究概况[J].中国老年学杂志，2005，25（10）：1269-1271.
[2] 赵坤英，解恒革.葛根总黄酮及葛根素对神经系统保护作用的研究进展[J].中国医药科学，2011，1（1）：65-67.
[3] 常明则，王新来，吴海琴，等.葛根素对血管性痴呆大鼠行为学及额叶细胞凋亡的影响[J].卒中与神经疾病，2009，16（3）：151-154.