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摘 要：为了研究雏鸡血浆中恩诺沙星和环丙沙星含量及代谢规律，建立了本HPLC方法。血浆样品中的药物采用乙腈提取和净化，荧光检测器检测，激发波长278nm，发射波长450nm;流动相为0.05mol/L磷酸/三乙胺-乙腈（82：18，V/V）溶液。结果表明，血浆中恩诺沙星和环丙沙星的含量在0.05～10mg/L浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数大于0.999。在低、中、高三个添加浓度（0.05、0.5、10mg/L）下平均回收率在87.26%～106.36%之间，日内变异系数低于8.97%，日间变异系数低于7.92%，检测限和定量限分别为0.01mg/L和0.05mg/L。本方法建立的血浆提取净化和检测条件可用于准确测定鸡血浆中恩诺沙星和环丙沙星的含量。
关键词：HPLC;恩诺沙星;方法学;雏鸡
氟喹诺酮药物因其抗菌谱广、杀菌作用强、吸收快、体内分布广与其他抗菌药物无交叉耐药性等特点，广泛用于人医临床与养殖业中[1]。生产上鸡白痢、鸡伤寒、鸡副伤寒和鸡支原体等病原体可通过种蛋感染雏鸡。目前唯一批准在雏鸡上使用的抗生素是头孢噻呋注射液，恩诺沙星是动物专用抗生素，对上述细菌感染有很好疗效[2]，同时部分药物在鸡体内代谢为环丙沙星[3]。目前恩诺沙星的检测方法有微生物法[4]、高效液相色谱法[5]和超高效液相串联质谱法等[6]。本文在前人报道的基础上[7～9]，通过色谱条件和血浆样品处理的优化，建立了雏鸡血浆中恩诺沙星和环丙沙星含量的HPLC方法，为进一步研究恩诺沙星注射液在雏鸡体内药动学特征和临床合理利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 仪器和试剂 Waters 2695高效液相色谱仪（Waters 2695，配Waters2475荧光检测器），购自美国Waters公司;纯水仪（UPH-11-20T），购自四川优普超纯科技有限公司;KQ-250B型超生波清洗器（KQ-250B型），购自昆山市超声仪器有限公司;氮吹仪（N-EVAP），购自美国Organomation公司;漩涡混合器（WH-3），购自上海沪西分析仪器厂有限公司;电子分析天平（BS124S），购自德国赛多利斯天平公司;高速冷冻离心机（5810R）、移液枪，购自德国Eppendorf公司。
恩诺沙星与环丙沙星标准品（PHLC≥99.5%），批号分别为H0081505、H0101310，购自中国兽医药品监察所;乙腈、甲醇均为色谱纯，美国天地有限公司生产;85%浓磷酸，德国CNW公司生产;氢氧化钠、三乙胺为分析纯，国药集团生产;水为超纯水。
1.2 溶液配制 精密称取恩诺沙星、环丙沙星标准品各10.05mg，分别置于10ml棕色容量瓶中，用0.03mol/L氢氧化钠溶液溶解。
1.2.1 标准溶液母液配制 甲醇定容浓度为1mg/ml的储备液，放置于4℃下保存备用，有效期6个月。
1.2.2 0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液配制 取浓磷酸3.4ml，用水稀释至1L，用三乙胺调pH值至3.0，备用。
1.2.3 流动相的配制 准确吸取18ml乙腈和82ml 0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液，涡旋混匀，备用。
1.2.4 标准溶液工作液的配制 准确量取适量环丙沙星、恩诺沙星标准储备液，用流动相稀释成适宜的混合标准工作液，置2～8℃冰箱中保存。
1.3 血浆样品处理 准确吸取0.2ml新鲜或冻融的血浆样品于1.5ml刻度离心管中涡旋1min混匀后静置10min，加入1ml乙腈，涡旋振荡3min，12000r/min离心10min。上清液移至10ml刻度离心管中，45℃氮气吹干溶剂流动相复溶，涡旋振荡1min，2000r/min离心1min，上清液经0.22μm滤膜过滤，取滤液，即得。
1.4 色谱条件 色谱柱：Agilent HP-C18（4.6×250mm，5μm）;流速：0.8ml/min;柱温：35℃;进样量：10μl;流动相：0.05mol/l磷酸/三乙胺（pH=3.0），乙腈（82：18，V/V）;荧光检测器：激发波长278nm，发射波长450nm。
1.5 标准曲线的绘制 准确吸取混合标准工作液，分别制得0.05、0.5、1、4、6和10mg/L混合标准溶液系列添加浓度。乙腈提取，氮气吹干流动相复溶，过0.22μm滤膜上机检测。
1.6 檢测限和定量限 制备5个平行空白血浆，按照1.3项下的血浆样品处理方法处理后，上机测得平均基线噪音值。准确吸取混合标准工作液，制得0.005、0.01、0.05和0.1mg/L添加浓度，按1.4色谱条件进样分析。取信噪比S/N≥3时样品的最低浓度为检测限（LOD），以信噪比S/N≥10时样品的最低浓度为最低定量限（LOQ）。
1.7 回收率和精密度的测定 准确取混合标准工作液，制得0.05、0.5、10mg/L三个浓度的添加样品，按1.3项下血浆样品预处理方法处理后供HPLC分析，确定其峰面积与相应的标准品直接进样的峰面积进行比较，计算回收率。
准确取混合标准工作液，分别制得0.05、0.5、10mg/L三个浓度的空白血浆添加样品，混匀后按“1.3”项下血浆样品预处理方法处理后，按1.4色谱条件进样分析，确定其峰面积。每个浓度水平设5个平行（日内），共重复考察3批（日间），计算出日内和日间变异系数。
1.8 干扰性试验 照上述血浆处理办法及色谱条件，分别取空白血浆、混合标准样品、空白加标样品、实测样品各10μl进行测定。 1.9 实际样品检测 10只体重约50g雏鸡颈部皮下注射恩诺沙星2mg/只，24h心脏采血1.5ml分装于抗凝管中，3000r/min离心10min分离出血浆，于-20℃冻存，待测。
2 结果与分析
2.1 标准曲线及线性关系考察 以色谱峰面积（S）为横坐标，以药物浓度（C）为纵坐标，绘制标准曲线。将数据进行线性回归，分别得到恩诺沙星与环丙沙星线性回归方程分别为：y=192513270.7x-112679.8;y=89631925.1x+36913113.7。结果表明，两者在0.05～10mg/L范围内呈良好线性关系，见表1。
2.2 检测限与定量限 在本试验建立的色谱条件下，血浆样品中的恩诺沙星和环丙沙星的检测限、定量限分别为0.01mg/L和0.05mg/L。
2.3 回收率和精密度 回收率和精密度测定结果见表2。结果环丙沙星与恩诺沙星低、中和高三个空白血浆添加浓度（0.05、0.5、10mg/L）下的平均回收率在87.26%～106.36%之间，日内变异系数低于8.97%，日间变异系数低于7.92%，符合《兽药质量标准分析方法验证指导原则》要求。
2.4 干扰性试验 在1.4色谱条件下，恩诺沙星、环丙沙星药峰峰型良好与血浆中其他组分无干扰。环丙沙星和恩诺沙星的出峰时间分别为7.1min和9.0min左右。空白血浆、混合标准样品、空白血浆加标和实测样品色谱图见图1～4。
2.5 实际样品检测结果 取5份恩诺沙星注射液皮下给药24h后血浆，采用本方法进行检测，测得的恩诺沙星平均浓度为0.96mg/L，环丙沙星未检出;按农业部1025号公告-14-2008《动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测高效液相色谱法》的色谱条件，血浆采用本文处理办法，测得恩诺沙星平均浓度为0.91mg/L，环丙沙星未检出。
3 讨论与结论
3.1 提取条件的优化 目前有关于氟喹诺酮类抗生素血浆中的提取主要通过甲醇[10]、乙腈[11]和乙酸乙酯等有机溶剂。本试验分别以1ml甲醇和乙腈对标准添加样品进行提取，结果显示采用甲醇和乙腈提取的回收率均达到85%以上无明显差异。鉴于在45℃氮吹条件下乙腈挥发速度较快，可缩短样品的处理时间，同时经离心后萃取液澄清透明，提高了样品的处理质量，故选用乙腈为提取剂。
3.2 色谱条件的优化 文献报道流动相主要采用甲醇-四丁基溴化胺[12]、乙睛-四丁基溴化胺[13]、乙睛-甲醇-磷酸盐[14]等。国标中以乙睛-磷酸溶液为流动相，采用荧光检测器检测，激发波长和发射波长分别为280nm和450nm[17]。通过全波长扫描在278nm处有最大吸收峰，流动相用三乙胺调pH值到3时，既可以有效将药物与基质分离，同时能避免峰拖尾现象。通过对柱温的筛选发现，在25～35℃范围内，柱温升高出峰时间略微提前，故确定柱温为35℃。对流动相中乙睛比例优化试验显示，乙睛比例过小洗脱不彻底杂质峰出现，乙睛比例加大则出峰时间前移检测时间缩短。在相同条件下，磷酸/三乙胺-乙腈比例为82：18（V/V）时分离效果最好。
在本试验所建立的HPLC条件下，血浆中恩诺沙星及其代谢物环丙沙星含量测定的方法灵敏度、准确度和重现性均满足检测要求，适用于鸡血浆中恩诺沙星和环丙沙星含量的测定。
参考文献：
[1] 丁焕中，杨大伟，孙永学，等.恩诺沙星、恩诺沙星钠和盐酸恩诺沙星在鸡体内的比较药动学[J].养禽与禽病防治，2009，（05）：6-8.
[2] EMEA.Committee for veterinary medicinal products （Enrofloxacin）[S].July 1998， 388/98-FINAL.
[3] OVANDO HG， et al. Comparative pharmacokinetics of enrofloxacin and ciprofloxacin in chickens[J].Vet Pharmacol Ther， 1999， 22（3）：209-212.
[4] OKERMAN L， et al. Detection of antibiotics in muscle tissue with microbiological inhibition tests： effects of the matrix[J]. Analyst， 1998，123（11）：2361-5.
[5] QUINTIN MCKELLAR， et al. Pharmacokinetics of Enrofloxacin and Danofloxacin in Plasma，Inflammatory Exudate， and Bronchial Secretions of Calves following Subcutaneous Administration[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy ， 1999， 43（8）：1988-1992.
[6] DE ASSIS DC， et al. Evaluation of the Presence and Levels of Enrofloxacin， Ciprofloxacin， Sulfaquinoxaline and Oxytetracycline in Broiler Chickens after Drug Administration[J]. PLoS ONE， 2016， 11（11）： 1～14.
[7] HARITOVA A，et al.Pharmacokinetic-pharmacodynamic indices of enrofloxacin in Escherichia coli O78/H12 infected chickens[J].Food Chem Toxicol，2011，49（7）：1531-1532.
[8] 劉荟岭.HPLC法测定禽血清和肌肉中恩诺沙星含量的方法改进与应用[D].哈尔滨：东北农业大学，2013.
[9] 蒋志伟.乳酸恩诺沙星可溶性粉在鸡的药动学及不同恩诺沙星盐制剂在鸡的残留消除规律研究[D].扬州：扬州大学，2010.
[10] 曾五和，陈杖榴，曾振灵，等.恩诺沙星混悬液在猪体内的药动学及生物利用度[J].畜牧兽医学报，2002，（01）：63-67.
[11] DEVREESE et al. Effect of administration route and dose escalation on plasma and intestinal concentrations of enrofloxacin and ciprofloxacin in broiler chickens[J]，BMC Veterinary Research，2014， 10：289-290.
[12] 胡功政，冯淇辉.恩诺沙星及其活性代谢物在鸡体内的药物动力学[J].中国兽医学报，1999，（02）：70-73.
[13] 房文红，胡琳琳，陈玉露，等.采用LC/MS法分析恩诺沙星在锯缘青蟹血浆中的代谢产物[J].海洋渔业，2008，（04）：350-355.
[14] 中华人民共和国农业农村部.动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测高效液相色谱法[S].农业部1025号公告-14-2008.
关键词：HPLC;恩诺沙星;方法学;雏鸡
氟喹诺酮药物因其抗菌谱广、杀菌作用强、吸收快、体内分布广与其他抗菌药物无交叉耐药性等特点，广泛用于人医临床与养殖业中[1]。生产上鸡白痢、鸡伤寒、鸡副伤寒和鸡支原体等病原体可通过种蛋感染雏鸡。目前唯一批准在雏鸡上使用的抗生素是头孢噻呋注射液，恩诺沙星是动物专用抗生素，对上述细菌感染有很好疗效[2]，同时部分药物在鸡体内代谢为环丙沙星[3]。目前恩诺沙星的检测方法有微生物法[4]、高效液相色谱法[5]和超高效液相串联质谱法等[6]。本文在前人报道的基础上[7～9]，通过色谱条件和血浆样品处理的优化，建立了雏鸡血浆中恩诺沙星和环丙沙星含量的HPLC方法，为进一步研究恩诺沙星注射液在雏鸡体内药动学特征和临床合理利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 仪器和试剂 Waters 2695高效液相色谱仪（Waters 2695，配Waters2475荧光检测器），购自美国Waters公司;纯水仪（UPH-11-20T），购自四川优普超纯科技有限公司;KQ-250B型超生波清洗器（KQ-250B型），购自昆山市超声仪器有限公司;氮吹仪（N-EVAP），购自美国Organomation公司;漩涡混合器（WH-3），购自上海沪西分析仪器厂有限公司;电子分析天平（BS124S），购自德国赛多利斯天平公司;高速冷冻离心机（5810R）、移液枪，购自德国Eppendorf公司。
恩诺沙星与环丙沙星标准品（PHLC≥99.5%），批号分别为H0081505、H0101310，购自中国兽医药品监察所;乙腈、甲醇均为色谱纯，美国天地有限公司生产;85%浓磷酸，德国CNW公司生产;氢氧化钠、三乙胺为分析纯，国药集团生产;水为超纯水。
1.2 溶液配制 精密称取恩诺沙星、环丙沙星标准品各10.05mg，分别置于10ml棕色容量瓶中，用0.03mol/L氢氧化钠溶液溶解。
1.2.1 标准溶液母液配制 甲醇定容浓度为1mg/ml的储备液，放置于4℃下保存备用，有效期6个月。
1.2.2 0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液配制 取浓磷酸3.4ml，用水稀释至1L，用三乙胺调pH值至3.0，备用。
1.2.3 流动相的配制 准确吸取18ml乙腈和82ml 0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液，涡旋混匀，备用。
1.2.4 标准溶液工作液的配制 准确量取适量环丙沙星、恩诺沙星标准储备液，用流动相稀释成适宜的混合标准工作液，置2～8℃冰箱中保存。
1.3 血浆样品处理 准确吸取0.2ml新鲜或冻融的血浆样品于1.5ml刻度离心管中涡旋1min混匀后静置10min，加入1ml乙腈，涡旋振荡3min，12000r/min离心10min。上清液移至10ml刻度离心管中，45℃氮气吹干溶剂流动相复溶，涡旋振荡1min，2000r/min离心1min，上清液经0.22μm滤膜过滤，取滤液，即得。
1.4 色谱条件 色谱柱：Agilent HP-C18（4.6×250mm，5μm）;流速：0.8ml/min;柱温：35℃;进样量：10μl;流动相：0.05mol/l磷酸/三乙胺（pH=3.0），乙腈（82：18，V/V）;荧光检测器：激发波长278nm，发射波长450nm。
1.5 标准曲线的绘制 准确吸取混合标准工作液，分别制得0.05、0.5、1、4、6和10mg/L混合标准溶液系列添加浓度。乙腈提取，氮气吹干流动相复溶，过0.22μm滤膜上机检测。
1.6 檢测限和定量限 制备5个平行空白血浆，按照1.3项下的血浆样品处理方法处理后，上机测得平均基线噪音值。准确吸取混合标准工作液，制得0.005、0.01、0.05和0.1mg/L添加浓度，按1.4色谱条件进样分析。取信噪比S/N≥3时样品的最低浓度为检测限（LOD），以信噪比S/N≥10时样品的最低浓度为最低定量限（LOQ）。
1.7 回收率和精密度的测定 准确取混合标准工作液，制得0.05、0.5、10mg/L三个浓度的添加样品，按1.3项下血浆样品预处理方法处理后供HPLC分析，确定其峰面积与相应的标准品直接进样的峰面积进行比较，计算回收率。
准确取混合标准工作液，分别制得0.05、0.5、10mg/L三个浓度的空白血浆添加样品，混匀后按“1.3”项下血浆样品预处理方法处理后，按1.4色谱条件进样分析，确定其峰面积。每个浓度水平设5个平行（日内），共重复考察3批（日间），计算出日内和日间变异系数。
1.8 干扰性试验 照上述血浆处理办法及色谱条件，分别取空白血浆、混合标准样品、空白加标样品、实测样品各10μl进行测定。 1.9 实际样品检测 10只体重约50g雏鸡颈部皮下注射恩诺沙星2mg/只，24h心脏采血1.5ml分装于抗凝管中，3000r/min离心10min分离出血浆，于-20℃冻存，待测。
2 结果与分析
2.1 标准曲线及线性关系考察 以色谱峰面积（S）为横坐标，以药物浓度（C）为纵坐标，绘制标准曲线。将数据进行线性回归，分别得到恩诺沙星与环丙沙星线性回归方程分别为：y=192513270.7x-112679.8;y=89631925.1x+36913113.7。结果表明，两者在0.05～10mg/L范围内呈良好线性关系，见表1。
2.2 检测限与定量限 在本试验建立的色谱条件下，血浆样品中的恩诺沙星和环丙沙星的检测限、定量限分别为0.01mg/L和0.05mg/L。
2.3 回收率和精密度 回收率和精密度测定结果见表2。结果环丙沙星与恩诺沙星低、中和高三个空白血浆添加浓度（0.05、0.5、10mg/L）下的平均回收率在87.26%～106.36%之间，日内变异系数低于8.97%，日间变异系数低于7.92%，符合《兽药质量标准分析方法验证指导原则》要求。
2.4 干扰性试验 在1.4色谱条件下，恩诺沙星、环丙沙星药峰峰型良好与血浆中其他组分无干扰。环丙沙星和恩诺沙星的出峰时间分别为7.1min和9.0min左右。空白血浆、混合标准样品、空白血浆加标和实测样品色谱图见图1～4。
2.5 实际样品检测结果 取5份恩诺沙星注射液皮下给药24h后血浆，采用本方法进行检测，测得的恩诺沙星平均浓度为0.96mg/L，环丙沙星未检出;按农业部1025号公告-14-2008《动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测高效液相色谱法》的色谱条件，血浆采用本文处理办法，测得恩诺沙星平均浓度为0.91mg/L，环丙沙星未检出。
3 讨论与结论
3.1 提取条件的优化 目前有关于氟喹诺酮类抗生素血浆中的提取主要通过甲醇[10]、乙腈[11]和乙酸乙酯等有机溶剂。本试验分别以1ml甲醇和乙腈对标准添加样品进行提取，结果显示采用甲醇和乙腈提取的回收率均达到85%以上无明显差异。鉴于在45℃氮吹条件下乙腈挥发速度较快，可缩短样品的处理时间，同时经离心后萃取液澄清透明，提高了样品的处理质量，故选用乙腈为提取剂。
3.2 色谱条件的优化 文献报道流动相主要采用甲醇-四丁基溴化胺[12]、乙睛-四丁基溴化胺[13]、乙睛-甲醇-磷酸盐[14]等。国标中以乙睛-磷酸溶液为流动相，采用荧光检测器检测，激发波长和发射波长分别为280nm和450nm[17]。通过全波长扫描在278nm处有最大吸收峰，流动相用三乙胺调pH值到3时，既可以有效将药物与基质分离，同时能避免峰拖尾现象。通过对柱温的筛选发现，在25～35℃范围内，柱温升高出峰时间略微提前，故确定柱温为35℃。对流动相中乙睛比例优化试验显示，乙睛比例过小洗脱不彻底杂质峰出现，乙睛比例加大则出峰时间前移检测时间缩短。在相同条件下，磷酸/三乙胺-乙腈比例为82：18（V/V）时分离效果最好。
在本试验所建立的HPLC条件下，血浆中恩诺沙星及其代谢物环丙沙星含量测定的方法灵敏度、准确度和重现性均满足检测要求，适用于鸡血浆中恩诺沙星和环丙沙星含量的测定。
参考文献：
[1] 丁焕中，杨大伟，孙永学，等.恩诺沙星、恩诺沙星钠和盐酸恩诺沙星在鸡体内的比较药动学[J].养禽与禽病防治，2009，（05）：6-8.
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[6] DE ASSIS DC， et al. Evaluation of the Presence and Levels of Enrofloxacin， Ciprofloxacin， Sulfaquinoxaline and Oxytetracycline in Broiler Chickens after Drug Administration[J]. PLoS ONE， 2016， 11（11）： 1～14.
[7] HARITOVA A，et al.Pharmacokinetic-pharmacodynamic indices of enrofloxacin in Escherichia coli O78/H12 infected chickens[J].Food Chem Toxicol，2011，49（7）：1531-1532.
[8] 劉荟岭.HPLC法测定禽血清和肌肉中恩诺沙星含量的方法改进与应用[D].哈尔滨：东北农业大学，2013.
[9] 蒋志伟.乳酸恩诺沙星可溶性粉在鸡的药动学及不同恩诺沙星盐制剂在鸡的残留消除规律研究[D].扬州：扬州大学，2010.
[10] 曾五和，陈杖榴，曾振灵，等.恩诺沙星混悬液在猪体内的药动学及生物利用度[J].畜牧兽医学报，2002，（01）：63-67.
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[12] 胡功政，冯淇辉.恩诺沙星及其活性代谢物在鸡体内的药物动力学[J].中国兽医学报，1999，（02）：70-73.
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