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摘要以宁夏枸杞为试验材料，利用同源克隆技术，设计简并引物，克隆得到一个新的甜菜碱醛脱氢酶基因。该基因全长cDNA为1 527个碱基，编码508个氨基酸，编码区两侧翼分别具有5′UTR （47 bp）和3′UTR （ 129 bp ）。在推导的氨基酸序列中，含有醛脱氢酶所具有的高度保守的十肽（VTlElGGKSP）以及与酶功能有关的半胱氨酸残基（C）。进化分析表明，它与番茄甜菜碱醛脱氢酶亲缘关系最近，与其他藜科植物亲缘关系较远。该基因的获得有助于理解枸杞这一盐生植物耐盐机理，为培育新的耐盐枸杞奠定理论基础。
关键词宁夏枸杞；同源克隆；BADH2
中图分类号S567.1+9文献标识码
A文章编号0517-6611（2014）35-12798-05
Abstract A new gene of Betaine Aldehyde Dehydrogenase （BADH）， named LbBADH2， was obtained by RACE technology in Lycium barbarum. The full cDNA of LbBADH is consist of 1 527 base pairs and encode 508 aa.， 5′UTR （47 bp） and 3′UTR （129 bp ） locating both side of it. A high conserved decapeptide sequence ‘VTLELGGKSP’ and Cys， which are related to the activity of enzyme， are found in putative amino acid among all BADH. The evolutional analysis showed that LbBADH2 is closer with Solanum lycopersicum than others plant in genetic relationship. The obtaining of LbBADH2 will help understanding the mechanism of salt tolerance and lay theoretical foundation for developing new salttolerance variety in Lycium barbarum.
Key words Lycium barbarum； Homocloning； BADH2
枸杞（Lycium barbarum L.）属于茄科枸杞属落叶灌木，也是其中唯一一属盐生植物，其根系发达，具有抗旱、耐盐碱、耐寒、耐瘠薄的特点，主要种植于轻度盐渍化地区，是盐渍化土地改良的先锋植物。在当前西部生态建设和中药材基地建设中，枸杞具有很高的生态、经济和社会价值[1- 2]。
甘氨酸甜菜碱（简称甜菜碱）是甘氨酸的衍生物，被认为是最好的渗透调节剂。在植物体
内，甜菜碱由胆碱经两步氧化生成，催化第2步反应的是甜菜碱醛脱氢酶（betaine aldehyde dehydrogenase，BADH）[3]。目前BAHD已经从盐节木（Halocnemum strobilaceum）[4]、盐穗木（Halostachys caspica）[5]、碱蓬（Suaeda liaotungensis）[6-7]、梭梭（Haloxylon ammodendron）[8]、菠菜（Spinacia oleracea）[9]、滨藜（Atriplex centralasiatica）[10]、山菠菜（Atriplex hortensis）[11]、甜菜（Beta vulgaris）[12]、盐爪爪（Kalidium foliatum）[13]等藜科植物，小麦（Triticum aestivum）[14]、水稻（Oryza sativa）、短芒大麦草（Hordeum brevisubulatum）等禾本科植物以及油菜（Brassica napus）[15]等其他植物中分离克隆。在盐生植物宁夏枸杞中虽然已经克隆了BADH1[16]，但在枸杞复杂的耐盐生理过程中是否存在除BAHD1外的甜菜碱醛脱氢酶尚未见报道。笔者以宁夏枸杞叶片为试验材料，利用同源克隆技术分离克隆到BADH2，从进化角度分析其在耐盐生理过程中的保守性。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1植物材料。
2013年5月，在宁夏枸杞种质资源圃中，取宁杞1号幼嫩枸杞根、茎、叶片、花等植物材料，低温冰盒保藏后带回实验室，然后置于-70 ℃冰箱中备用，随后提取总RNA。
1.1.2载体与试剂。
RNA提取试剂盒为SV Total RNA Isolation System（Promega）； RNA反转录试剂盒为mPromII Reverse Transcriptase（Promega）、离心柱型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为Wizard SV Gel and PCR Cleanup System（Promega）；T连接载体试剂盒为pGEMT easy II Vector（Promega），5′RACE和3′RACE试剂盒均为Takara公司产品，Taq DNA聚合酶与DNA分子量marker为Tiangen公司产品；引物由北京奥科公司合成；其余试剂均为分析纯。
1.2方法
1.2.1总RNA的提取。按Promega 公司SV Total RNA Isolation System试剂盒操作指南进行。
1.2.2总cDNA的反转录。
按Promega 公司mPromII Reverse Transcriptase试剂盒进行。取2 μg枸杞叶片总RNA，以Oligo dT为引物，进行总cDNA反转录。反应体系为20 μl，MMlV RT buffer 4 μl，总RNA 2 μl，dNTP 2 μl，反转录酶MMlV 1 μl，Oligo （dT）16 1 μl，RNA酶抑制剂RNasesin 0.5 μl，加DEPC处理的H2O 至20 μl。反转录反应为42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，3 ℃ 3 min。反转录产物置于-20 ℃备用。 1.2.3BADH基因核心序列的PCR扩增 。
根据GenBank上已发表的BADH基因序列（GenBank登录号分别为FJ228482、BT013588、FJ514799、DQ497233、DQ923617）设计一对简并引物，从枸杞叶片cDNA扩增该基因的核心片段。上游引物为P1（CGNCARYVTTTCATYGAYGG），下游引物为P2（TTCYCCDAGYTCDCGBCCAAA NCCRCTRCG），预期扩增片段大小为1 392 bp。PCR反应体系为25 μl，包含10×buffer 2.5 μl，dNTP（2.5 mmol/μl）1.5 μl，上、下游引物（10 μmol/μl）各1 μl，Taq聚合酶（5 U/μl）1 μl，总cDNA（1 μg/μl）1 μl，加ddH2O至25 μl。反应程序为94 ℃预变性5 min，94 ℃ 变性30 s、50 ℃退火40 s、72 ℃延伸50 s，30个循环后，72 ℃延伸10 min。
1.2.4BADH基因3′RACE扩增。
根据其他已发表物种的BADH2基因cDNA序列设计BADH2基因的3′ RACE的引物P3（CTGAAGAGG AAGCCATTGAG）和P4（TTCTCAGTCAGGGTGTGTC），按照Takara 3′Full RACECore Set Ver.2.0说明书进行3′ RACE扩增，预期扩增片段大小为362 bp。
1.2.5BADH基因5′RACE扩增。
根据其他已发表物种的BADH2基因cDNA序列设计5′RACE引物P5（TCAGGATGTGAAACCAAAGGAGAACCAG）和P6（GAGGTAATAGATGCCATTTCAGACGGCT），按照Takara 5′Full RACE Kit 说明书进行5′ RACE 扩增，预期扩增片段大小为628 bp。
1.3克隆与测序
1.3.1BADH2基因完整序列的测序与拼接。所有基因片段送北京天根生物公司测序。将核心序列、3′ RACE测序结果与5′ RACE 测序结果进行拼接，所得即为BADH2基因cDNA 的完整序列。
1.3.2BADH2基因cDNA 完整ORF的PCR扩增。
根据测序结果，设计BADH2基因完整ORF序列的上游引物P7（GAAAAACTCATATCAGTAGCATTTAGC）和下游引物P8（GCTCTTAAAGATGAAATAAACAGAAGAGG），以枸杞叶片反转录产物为模板，进行PCR扩增，测序确认，预期扩增片段大小为1 527 bp。
1.4BADH2基因的进化分析
采用www.ncbi.nlm.nih.gov中的BlAST软件、DNAMAN7.0，对编码BADH2蛋白基因序列进行生物信息学分析；采用MEGA 5.05软件绘制进化树，计算方法采用Neighborjoining方法，Bootstrap 设置为1 000[9]。
安徽农业科学2014年
2结果与分析
2.1LbBADH2 cDNA序列的获得
以枸杞叶片cDNA为模板，设计简并引物扩增LbBADH2保守核心序列，扩增片段大小为1 392 bp（图1），与预期大小一致，测序获得LbBADH2保守核心序列；3′ RACE扩增片段大小为362 bp（图2），与设计一致，测序后获得LbBADH2 3′序列；5′ RACE结果扩增片段大小为628 bp（图4），与设计一致，测序后获得LbBADH2 5′序列；将 LbBADH2保守核心片段、3′片段、5′片段序用DNAMAN（V7.0）生物软件进行拼接，重新设计引物，扩增该基因全长序列，扩增大小
3讨论
在植物中BADH基因是以小的多基因家族的形式存在。在甜菜BADH基因的研究中，发现在单倍体基因组中至少有2个相关序列[19]。在水稻中也发现有大量乙醛酸脱氢酶（AlDH） 基因家族[20]，大麦中含有一个2～3个成员小的多基因家族[21]；胡杨[22]、甘菊[23]、三角叶滨藜[24]均克隆到该基因的2个成员。 这种多个转录产物有可能是一个转录本不同剪切方式造成，甘菊2个基因可能是由于此方式造成。但从枸杞2个基因比对和进化分析看出，推测它们是由不同基因所编码。这2个基因在应答盐胁迫时，不同的响应方式及表达模式还需进一步研究。
在已报道的BADH氨基酸序列中，存在2种有关该酶蛋白定位的信号肽。一种是N 端信号肽，其氨基酸序列为QlF IDGE，被认为是定位于叶绿体的信号，但该信号肽缺乏典型性；另一种是C 端信号肽，氨基酸序列为SKl，是定位于过氧化物酶体中的信号。从目前研究结果看，将具有C 端信号肽SKl的BADH定位于过氧化物酶体已无争议，但对具有不典型N 端信号肽的BADH定位问题尚有争论。在LbBADH2推导的氨基酸序列中，含有醛脱氢酶所具有的高度保守的十肽（VTlElGGKSP）以及与酶功能有关的半胱氨酸残基（C）。这些残基可能包含NAD+结合位点和酶催化位点[17]。 在5′端含有不典型的信号肽QlFIDGE，表明该酶可能定位于叶绿体中[18]
提高农作物（大豆[25]、玉米[26]）、牧草（苜蓿[27]）耐盐性的BADH基因转化已有报道，该研究所克隆的宁夏枸杞BADH2基因为耐盐植物定向培育提供了选择空间。
参考文献
[1]
毛桂莲，许兴.枸杞耐盐突变体的筛选及生理生化分析[J].西北植物学报，2005，25（2）：275-280.
[2] 孟凤，郁松林，郑强卿，等.甜菜碱与植物抗逆性关系之研究进展 [J].中国农学通报，2008，24（4）：225-228. [3] 梁峥，骆爱玲.甜菜碱和甜菜碱合成酶 [J].植物生理学通讯，1995，31（1）：1-8.
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[6] 李秋莉，张毅，尹辉，等.辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶基因（BADH）启动子分离及序列分析 [J].生物工程学报，2006，22（1）：77-81.
[7] 王三红，陶建敏，张红梅，等.盐地碱蓬甜菜碱合成酶基因的克隆及植物共表达载体的构建（英文） [J].西北植物学报，2007（2）：215-222.
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关键词宁夏枸杞；同源克隆；BADH2
中图分类号S567.1+9文献标识码
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Abstract A new gene of Betaine Aldehyde Dehydrogenase （BADH）， named LbBADH2， was obtained by RACE technology in Lycium barbarum. The full cDNA of LbBADH is consist of 1 527 base pairs and encode 508 aa.， 5′UTR （47 bp） and 3′UTR （129 bp ） locating both side of it. A high conserved decapeptide sequence ‘VTLELGGKSP’ and Cys， which are related to the activity of enzyme， are found in putative amino acid among all BADH. The evolutional analysis showed that LbBADH2 is closer with Solanum lycopersicum than others plant in genetic relationship. The obtaining of LbBADH2 will help understanding the mechanism of salt tolerance and lay theoretical foundation for developing new salttolerance variety in Lycium barbarum.
Key words Lycium barbarum； Homocloning； BADH2
枸杞（Lycium barbarum L.）属于茄科枸杞属落叶灌木，也是其中唯一一属盐生植物，其根系发达，具有抗旱、耐盐碱、耐寒、耐瘠薄的特点，主要种植于轻度盐渍化地区，是盐渍化土地改良的先锋植物。在当前西部生态建设和中药材基地建设中，枸杞具有很高的生态、经济和社会价值[1- 2]。
甘氨酸甜菜碱（简称甜菜碱）是甘氨酸的衍生物，被认为是最好的渗透调节剂。在植物体
内，甜菜碱由胆碱经两步氧化生成，催化第2步反应的是甜菜碱醛脱氢酶（betaine aldehyde dehydrogenase，BADH）[3]。目前BAHD已经从盐节木（Halocnemum strobilaceum）[4]、盐穗木（Halostachys caspica）[5]、碱蓬（Suaeda liaotungensis）[6-7]、梭梭（Haloxylon ammodendron）[8]、菠菜（Spinacia oleracea）[9]、滨藜（Atriplex centralasiatica）[10]、山菠菜（Atriplex hortensis）[11]、甜菜（Beta vulgaris）[12]、盐爪爪（Kalidium foliatum）[13]等藜科植物，小麦（Triticum aestivum）[14]、水稻（Oryza sativa）、短芒大麦草（Hordeum brevisubulatum）等禾本科植物以及油菜（Brassica napus）[15]等其他植物中分离克隆。在盐生植物宁夏枸杞中虽然已经克隆了BADH1[16]，但在枸杞复杂的耐盐生理过程中是否存在除BAHD1外的甜菜碱醛脱氢酶尚未见报道。笔者以宁夏枸杞叶片为试验材料，利用同源克隆技术分离克隆到BADH2，从进化角度分析其在耐盐生理过程中的保守性。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1植物材料。
2013年5月，在宁夏枸杞种质资源圃中，取宁杞1号幼嫩枸杞根、茎、叶片、花等植物材料，低温冰盒保藏后带回实验室，然后置于-70 ℃冰箱中备用，随后提取总RNA。
1.1.2载体与试剂。
RNA提取试剂盒为SV Total RNA Isolation System（Promega）； RNA反转录试剂盒为mPromII Reverse Transcriptase（Promega）、离心柱型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为Wizard SV Gel and PCR Cleanup System（Promega）；T连接载体试剂盒为pGEMT easy II Vector（Promega），5′RACE和3′RACE试剂盒均为Takara公司产品，Taq DNA聚合酶与DNA分子量marker为Tiangen公司产品；引物由北京奥科公司合成；其余试剂均为分析纯。
1.2方法
1.2.1总RNA的提取。按Promega 公司SV Total RNA Isolation System试剂盒操作指南进行。
1.2.2总cDNA的反转录。
按Promega 公司mPromII Reverse Transcriptase试剂盒进行。取2 μg枸杞叶片总RNA，以Oligo dT为引物，进行总cDNA反转录。反应体系为20 μl，MMlV RT buffer 4 μl，总RNA 2 μl，dNTP 2 μl，反转录酶MMlV 1 μl，Oligo （dT）16 1 μl，RNA酶抑制剂RNasesin 0.5 μl，加DEPC处理的H2O 至20 μl。反转录反应为42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，3 ℃ 3 min。反转录产物置于-20 ℃备用。 1.2.3BADH基因核心序列的PCR扩增 。
根据GenBank上已发表的BADH基因序列（GenBank登录号分别为FJ228482、BT013588、FJ514799、DQ497233、DQ923617）设计一对简并引物，从枸杞叶片cDNA扩增该基因的核心片段。上游引物为P1（CGNCARYVTTTCATYGAYGG），下游引物为P2（TTCYCCDAGYTCDCGBCCAAA NCCRCTRCG），预期扩增片段大小为1 392 bp。PCR反应体系为25 μl，包含10×buffer 2.5 μl，dNTP（2.5 mmol/μl）1.5 μl，上、下游引物（10 μmol/μl）各1 μl，Taq聚合酶（5 U/μl）1 μl，总cDNA（1 μg/μl）1 μl，加ddH2O至25 μl。反应程序为94 ℃预变性5 min，94 ℃ 变性30 s、50 ℃退火40 s、72 ℃延伸50 s，30个循环后，72 ℃延伸10 min。
1.2.4BADH基因3′RACE扩增。
根据其他已发表物种的BADH2基因cDNA序列设计BADH2基因的3′ RACE的引物P3（CTGAAGAGG AAGCCATTGAG）和P4（TTCTCAGTCAGGGTGTGTC），按照Takara 3′Full RACECore Set Ver.2.0说明书进行3′ RACE扩增，预期扩增片段大小为362 bp。
1.2.5BADH基因5′RACE扩增。
根据其他已发表物种的BADH2基因cDNA序列设计5′RACE引物P5（TCAGGATGTGAAACCAAAGGAGAACCAG）和P6（GAGGTAATAGATGCCATTTCAGACGGCT），按照Takara 5′Full RACE Kit 说明书进行5′ RACE 扩增，预期扩增片段大小为628 bp。
1.3克隆与测序
1.3.1BADH2基因完整序列的测序与拼接。所有基因片段送北京天根生物公司测序。将核心序列、3′ RACE测序结果与5′ RACE 测序结果进行拼接，所得即为BADH2基因cDNA 的完整序列。
1.3.2BADH2基因cDNA 完整ORF的PCR扩增。
根据测序结果，设计BADH2基因完整ORF序列的上游引物P7（GAAAAACTCATATCAGTAGCATTTAGC）和下游引物P8（GCTCTTAAAGATGAAATAAACAGAAGAGG），以枸杞叶片反转录产物为模板，进行PCR扩增，测序确认，预期扩增片段大小为1 527 bp。
1.4BADH2基因的进化分析
采用www.ncbi.nlm.nih.gov中的BlAST软件、DNAMAN7.0，对编码BADH2蛋白基因序列进行生物信息学分析；采用MEGA 5.05软件绘制进化树，计算方法采用Neighborjoining方法，Bootstrap 设置为1 000[9]。
安徽农业科学2014年
2结果与分析
2.1LbBADH2 cDNA序列的获得
以枸杞叶片cDNA为模板，设计简并引物扩增LbBADH2保守核心序列，扩增片段大小为1 392 bp（图1），与预期大小一致，测序获得LbBADH2保守核心序列；3′ RACE扩增片段大小为362 bp（图2），与设计一致，测序后获得LbBADH2 3′序列；5′ RACE结果扩增片段大小为628 bp（图4），与设计一致，测序后获得LbBADH2 5′序列；将 LbBADH2保守核心片段、3′片段、5′片段序用DNAMAN（V7.0）生物软件进行拼接，重新设计引物，扩增该基因全长序列，扩增大小
3讨论
在植物中BADH基因是以小的多基因家族的形式存在。在甜菜BADH基因的研究中，发现在单倍体基因组中至少有2个相关序列[19]。在水稻中也发现有大量乙醛酸脱氢酶（AlDH） 基因家族[20]，大麦中含有一个2～3个成员小的多基因家族[21]；胡杨[22]、甘菊[23]、三角叶滨藜[24]均克隆到该基因的2个成员。 这种多个转录产物有可能是一个转录本不同剪切方式造成，甘菊2个基因可能是由于此方式造成。但从枸杞2个基因比对和进化分析看出，推测它们是由不同基因所编码。这2个基因在应答盐胁迫时，不同的响应方式及表达模式还需进一步研究。
在已报道的BADH氨基酸序列中，存在2种有关该酶蛋白定位的信号肽。一种是N 端信号肽，其氨基酸序列为QlF IDGE，被认为是定位于叶绿体的信号，但该信号肽缺乏典型性；另一种是C 端信号肽，氨基酸序列为SKl，是定位于过氧化物酶体中的信号。从目前研究结果看，将具有C 端信号肽SKl的BADH定位于过氧化物酶体已无争议，但对具有不典型N 端信号肽的BADH定位问题尚有争论。在LbBADH2推导的氨基酸序列中，含有醛脱氢酶所具有的高度保守的十肽（VTlElGGKSP）以及与酶功能有关的半胱氨酸残基（C）。这些残基可能包含NAD+结合位点和酶催化位点[17]。 在5′端含有不典型的信号肽QlFIDGE，表明该酶可能定位于叶绿体中[18]
提高农作物（大豆[25]、玉米[26]）、牧草（苜蓿[27]）耐盐性的BADH基因转化已有报道，该研究所克隆的宁夏枸杞BADH2基因为耐盐植物定向培育提供了选择空间。
参考文献
[1]
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