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摘要：目的 优选两头尖的提取工艺条件。方法 以竹节香附素A提取率为考察指标，采用响应面试验设计考察乙醇浓度、液料比、提取时间对两头尖提取工艺的影响。结果 优化的提取工艺条件为：乙醇浓度82%，液料比为11.7∶1，提取2次，每次2 h。在该优化条件下，竹节香附素A的提取率为2.24 mg/g。结论 该优化工艺简便、预测性良好，可以为两头尖的开发提供参考。
关键词：两头尖；响应面法；竹节香附素A
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.03.016
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）03-0066-03
Optimization of Extraction Anemones Raddeanae Rhizoma by Using Response Surface Method ZHAO Xu， WANG Kun， WANG Nan-fei （Henan Province Hospital of TCM， Zhengzhou 450002， China）
Abstract： Objective To optimize the extraction process of Anemones Raddeanae Rhizoma. Methods The extraction rate of raddeanin A was set as response value， and response surface method was employed to investigate the influence of ethanol concentration， extraction time and the amount of alcohol added on the extraction process of Anemones Raddeanae Rhizoma. Results Optimized extraction technology was： extracted 2 times with 11.7 times the amount of 82% ethanol， 2 h per time. Under this optimization process， the extraction rate of raddeanin A was 2.24 mg/g. Conclusion The optimized extraction process can provide a reference for production.
Key words： Anemones Raddeanae Rhizoma； response surface method； raddeanin A
兩头尖为毛茛科植物多被银莲花Anemone raddeana Regel的干燥根茎，具有祛风湿、消痈肿功效，用于治疗风寒湿痹、四肢拘挛、骨节疼痛、痈肿溃烂等[1]。现代研究发现，两头尖抗肿瘤作用显著，其主要化学成分为皂苷类，其中竹节香附素A含量较高，抗肿瘤活性较强[2-3]。
目前两头尖的提取工艺研究设计方法主要为正交试验法[4]，提取方法有超临界提取法[5]、回流提取法[6]、微波提取法[7]等，一般以总皂苷为指标性成分。响应面法目前已广泛应用于中药提取工艺研究的试验设计[8-10]，其分析方法直观，精密度更高，预测性更好。本研究运用响应面法进行试验设计，以竹节香附素A为考察指标，优选两头尖加热回流提取工艺。
1 仪器与试药
Aglient-1260高效液相色谱仪，二极管阵列检测器，安捷伦科技（中国）有限公司；AE240型十万分
基金项目：河南省科技公共计划项目（132102310243）
之一电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；电子恒温水浴锅，北京中兴伟业仪器有限公司。
竹节香附素A对照品（批号110718-201108），中国食品药品检定研究院。两头尖购于亳州药材市场，经河南省中医院黄小敏副主任中药师鉴定为毛茛科植物多被银莲花Anemone raddeana Regel的干燥根茎。乙腈、甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水。
2 方法与结果
2.1 竹节香附素A含量测定
2.1.1 色谱条件 Agilent TC-C18色谱柱（5 ?m，4.6 mm×250 mm），十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为乙腈，B为0.1%磷酸溶液，梯度洗脱（0～7 min，47%A；7～5 min，47%～55%A），检测波长206 nm，柱温25 ℃，流速1 mL/min。理论塔板数以竹节香附素A计算不低于4000。
2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取竹节香附素A对照品1.10 mg置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，即得。
2.1.3 供试品溶液的制备 称取两头尖粗粉3 g，按正交试验设计的条件加热回流提取，滤纸过滤收集提取液，水浴挥干后用甲醇定容至50 mL容量瓶中，经0.45 ?m微孔滤膜过滤，即得。
2.1.4 标准曲线的制备 取竹节香附素A对照品溶液2、4、6、8、10、12 ?L，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程Y=513.47X-0.060 7（r2=1），竹节香附素A线性范围为0.22～1.32 ?g。
2.1.5 精密度试验 取竹节香附素A对照品溶液，重复进样6次，每次10 ?L，按“2.1.1”项下色谱条件测定，计算竹节香附素A峰面积RSD=1.88%，表明仪器精密度良好。 2.1.6 稳定性试验 称取两头尖粗粉3 g，按供试品溶液制备方法制备（10倍量90%乙醇提取2次，每次1.5 h），分别放置0、2、4、6、8 h后进样，进样量10 ?L，按“2.1.1”项下色譜条件测定，计算竹节香附素A峰面积RSD=2.14%，表明供试品溶液在8 h内稳定。
2.1.7 重复性试验 称取两头尖粗粉6份，每份3 g，按供试品溶液制备方法制备（10倍量90%乙醇提取2次，每次1.5 h），分别进样10 ?L，按“2.1.1”项下色谱条件测定，计算竹节香附素A峰面积RSD=2.96%，表明方法重复性良好。
2.1.8 加样回收率试验 称取已知含量的两头尖提取液6份，每份1 mL，置于10 mL量瓶中，加入相当于两头尖提取液中含有量的竹节香附素A对照品，加甲醇定容，计算平均回收率为98.43%，RSD=1.97%，结果表明本法回收率良好。
2.2 提取工艺优选
在预试验的基础上，固定提取次数为2次，选择乙醇浓度、液料比、提取时间为自变量，以竹节香附素A提取率为响应值，设计三因素三水平中心复合试验，因素水平见表1。
称取两头尖粗粉，按试验设计方案提取，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定竹节香附素A含量，试验安排及结果见表2。采用Design Expert 8.06软件对所得数据进行回归分析，结果见表3。
经Design Expert 8.06软件拟合，得竹节香附素A提取率Y对乙醇浓度、提取时间、液料比的回归方程Y=2.45+0.15A+0.077B+0.20C-0.007 5AB+0.36AC+0.097BC-0.30A2-0.086B2-0.27C2。
由表3可知，模型回归P值为0.000 4，说明模型回归显著可靠；失拟误差P值为0.426 8（P>0.05），说明失拟度不明显；相关系数r2=0.961 0，调整值为0.910 8，说明该方程拟合度较高，该模型可以预测两头尖提取工艺过程。
乙醇浓度、液料比、乙醇浓度与液料比的交互作用、乙醇浓度的平方对综合评分的影响较显著（P<0.05），在3个因素之间，乙醇浓度对试验结果的影响最大。
根据二次多项式方程，分别绘制各指标与响应值交互项的响应曲面图，以确定各因素对两头尖提取工艺的影响，结果见图1～图3。
通过Design Expert 8.06软件计算并分析得到提取工艺的最优条件为：81.56%乙醇提取2次，每次1.97 h，液料比为11.69∶1，预测竹节香附素A提取率为2.57 mg/g。结合实际生产确定优化提取工艺为：11.7倍量82%乙醇提取2次，每次2 h。
2.3 验证试验
取同一批两头尖，精密称取粗粉3份，每份3 g，按照优选的提取工艺进行提取，计算竹节香附素A平均提取率为2.61 mg/g，RSD=2.58%，与预测值偏差较小，说明优选的提取工艺稳定可靠。
3 讨论
近年来，两头尖的抗肿瘤作用使其临床应用越来越广泛，但现阶段两头尖有效成分提取工艺的研究较少，主要采用正交试验法进行研究。响应面法目前已经广泛应用于中药提取工艺研究。
本研究在预试验的基础上首先固定提取次数为2次，通过响应面法分析提取时间、乙醇浓度、液料比3个因素对两头尖提取工艺的影响，通过回归分析表明，模拟的二次项方程具有可预测性。本研究可以为两头尖的提取开发提供依据。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：168-169.
[2] 路金才，徐琲琲，张新艳，等.两头尖的化学成分研究[J].药学学报， 2002，37（9）：709-712.
[3] 任风芝，张雪霞，牛桂云，等.两头尖的抗肿瘤活性成分研究[J].中草药，2005，36（12）：1775-1778.
[4] 李国军，王扎根，王风光.两头尖总皂提取条件优化研究[J].中国保健营养，2012，22（36）：2283-2284.
[5] 马晓红，姚向阳，韩凤梅，等.超临界CO2萃取两头尖皂甙研究[J].湖北大学学报：自然科学版，2003，25（2）：156-159.
[6] 李成，邱智东，金成赞，等.正交实验法优化两头尖总皂苷提取工艺[J].延边大学医学学报，2003，26（2）：101-103.
[7] 李会芳，李孝波，闫菁华，等.正交设计法优化两头尖总皂苷微波提取工艺[J].中华中医药学刊，2011，29（3）：553-555.
[8] 徐璐，汪涛，郭巧生，等.响应面法优化超声辅助法提取昆仑雪菊色素的工艺研究[J].中国中药杂志，2014，39（24）：4792-4797.
[9] 侯小涛，刘鹏，邓家刚，等.均匀设计优选甘蔗叶多糖颗粒制备工艺[J].中成药，2014，36（12）：2636-2639.
[10] 符少莲，冯翠娟，李沙.星点设计-效应面法优化脂溶性丹参提取物速释滴丸处方工艺[J].中成药，2013，35（4）：690-695.
（收稿日期：2016-04-28）
（修回日期：2016-05-17；编辑：陈静）
关键词：两头尖；响应面法；竹节香附素A
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.03.016
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）03-0066-03
Optimization of Extraction Anemones Raddeanae Rhizoma by Using Response Surface Method ZHAO Xu， WANG Kun， WANG Nan-fei （Henan Province Hospital of TCM， Zhengzhou 450002， China）
Abstract： Objective To optimize the extraction process of Anemones Raddeanae Rhizoma. Methods The extraction rate of raddeanin A was set as response value， and response surface method was employed to investigate the influence of ethanol concentration， extraction time and the amount of alcohol added on the extraction process of Anemones Raddeanae Rhizoma. Results Optimized extraction technology was： extracted 2 times with 11.7 times the amount of 82% ethanol， 2 h per time. Under this optimization process， the extraction rate of raddeanin A was 2.24 mg/g. Conclusion The optimized extraction process can provide a reference for production.
Key words： Anemones Raddeanae Rhizoma； response surface method； raddeanin A
兩头尖为毛茛科植物多被银莲花Anemone raddeana Regel的干燥根茎，具有祛风湿、消痈肿功效，用于治疗风寒湿痹、四肢拘挛、骨节疼痛、痈肿溃烂等[1]。现代研究发现，两头尖抗肿瘤作用显著，其主要化学成分为皂苷类，其中竹节香附素A含量较高，抗肿瘤活性较强[2-3]。
目前两头尖的提取工艺研究设计方法主要为正交试验法[4]，提取方法有超临界提取法[5]、回流提取法[6]、微波提取法[7]等，一般以总皂苷为指标性成分。响应面法目前已广泛应用于中药提取工艺研究的试验设计[8-10]，其分析方法直观，精密度更高，预测性更好。本研究运用响应面法进行试验设计，以竹节香附素A为考察指标，优选两头尖加热回流提取工艺。
1 仪器与试药
Aglient-1260高效液相色谱仪，二极管阵列检测器，安捷伦科技（中国）有限公司；AE240型十万分
基金项目：河南省科技公共计划项目（132102310243）
之一电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；电子恒温水浴锅，北京中兴伟业仪器有限公司。
竹节香附素A对照品（批号110718-201108），中国食品药品检定研究院。两头尖购于亳州药材市场，经河南省中医院黄小敏副主任中药师鉴定为毛茛科植物多被银莲花Anemone raddeana Regel的干燥根茎。乙腈、甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水。
2 方法与结果
2.1 竹节香附素A含量测定
2.1.1 色谱条件 Agilent TC-C18色谱柱（5 ?m，4.6 mm×250 mm），十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为乙腈，B为0.1%磷酸溶液，梯度洗脱（0～7 min，47%A；7～5 min，47%～55%A），检测波长206 nm，柱温25 ℃，流速1 mL/min。理论塔板数以竹节香附素A计算不低于4000。
2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取竹节香附素A对照品1.10 mg置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，即得。
2.1.3 供试品溶液的制备 称取两头尖粗粉3 g，按正交试验设计的条件加热回流提取，滤纸过滤收集提取液，水浴挥干后用甲醇定容至50 mL容量瓶中，经0.45 ?m微孔滤膜过滤，即得。
2.1.4 标准曲线的制备 取竹节香附素A对照品溶液2、4、6、8、10、12 ?L，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程Y=513.47X-0.060 7（r2=1），竹节香附素A线性范围为0.22～1.32 ?g。
2.1.5 精密度试验 取竹节香附素A对照品溶液，重复进样6次，每次10 ?L，按“2.1.1”项下色谱条件测定，计算竹节香附素A峰面积RSD=1.88%，表明仪器精密度良好。 2.1.6 稳定性试验 称取两头尖粗粉3 g，按供试品溶液制备方法制备（10倍量90%乙醇提取2次，每次1.5 h），分别放置0、2、4、6、8 h后进样，进样量10 ?L，按“2.1.1”项下色譜条件测定，计算竹节香附素A峰面积RSD=2.14%，表明供试品溶液在8 h内稳定。
2.1.7 重复性试验 称取两头尖粗粉6份，每份3 g，按供试品溶液制备方法制备（10倍量90%乙醇提取2次，每次1.5 h），分别进样10 ?L，按“2.1.1”项下色谱条件测定，计算竹节香附素A峰面积RSD=2.96%，表明方法重复性良好。
2.1.8 加样回收率试验 称取已知含量的两头尖提取液6份，每份1 mL，置于10 mL量瓶中，加入相当于两头尖提取液中含有量的竹节香附素A对照品，加甲醇定容，计算平均回收率为98.43%，RSD=1.97%，结果表明本法回收率良好。
2.2 提取工艺优选
在预试验的基础上，固定提取次数为2次，选择乙醇浓度、液料比、提取时间为自变量，以竹节香附素A提取率为响应值，设计三因素三水平中心复合试验，因素水平见表1。
称取两头尖粗粉，按试验设计方案提取，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定竹节香附素A含量，试验安排及结果见表2。采用Design Expert 8.06软件对所得数据进行回归分析，结果见表3。
经Design Expert 8.06软件拟合，得竹节香附素A提取率Y对乙醇浓度、提取时间、液料比的回归方程Y=2.45+0.15A+0.077B+0.20C-0.007 5AB+0.36AC+0.097BC-0.30A2-0.086B2-0.27C2。
由表3可知，模型回归P值为0.000 4，说明模型回归显著可靠；失拟误差P值为0.426 8（P>0.05），说明失拟度不明显；相关系数r2=0.961 0，调整值为0.910 8，说明该方程拟合度较高，该模型可以预测两头尖提取工艺过程。
乙醇浓度、液料比、乙醇浓度与液料比的交互作用、乙醇浓度的平方对综合评分的影响较显著（P<0.05），在3个因素之间，乙醇浓度对试验结果的影响最大。
根据二次多项式方程，分别绘制各指标与响应值交互项的响应曲面图，以确定各因素对两头尖提取工艺的影响，结果见图1～图3。
通过Design Expert 8.06软件计算并分析得到提取工艺的最优条件为：81.56%乙醇提取2次，每次1.97 h，液料比为11.69∶1，预测竹节香附素A提取率为2.57 mg/g。结合实际生产确定优化提取工艺为：11.7倍量82%乙醇提取2次，每次2 h。
2.3 验证试验
取同一批两头尖，精密称取粗粉3份，每份3 g，按照优选的提取工艺进行提取，计算竹节香附素A平均提取率为2.61 mg/g，RSD=2.58%，与预测值偏差较小，说明优选的提取工艺稳定可靠。
3 讨论
近年来，两头尖的抗肿瘤作用使其临床应用越来越广泛，但现阶段两头尖有效成分提取工艺的研究较少，主要采用正交试验法进行研究。响应面法目前已经广泛应用于中药提取工艺研究。
本研究在预试验的基础上首先固定提取次数为2次，通过响应面法分析提取时间、乙醇浓度、液料比3个因素对两头尖提取工艺的影响，通过回归分析表明，模拟的二次项方程具有可预测性。本研究可以为两头尖的提取开发提供依据。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：168-169.
[2] 路金才，徐琲琲，张新艳，等.两头尖的化学成分研究[J].药学学报， 2002，37（9）：709-712.
[3] 任风芝，张雪霞，牛桂云，等.两头尖的抗肿瘤活性成分研究[J].中草药，2005，36（12）：1775-1778.
[4] 李国军，王扎根，王风光.两头尖总皂提取条件优化研究[J].中国保健营养，2012，22（36）：2283-2284.
[5] 马晓红，姚向阳，韩凤梅，等.超临界CO2萃取两头尖皂甙研究[J].湖北大学学报：自然科学版，2003，25（2）：156-159.
[6] 李成，邱智东，金成赞，等.正交实验法优化两头尖总皂苷提取工艺[J].延边大学医学学报，2003，26（2）：101-103.
[7] 李会芳，李孝波，闫菁华，等.正交设计法优化两头尖总皂苷微波提取工艺[J].中华中医药学刊，2011，29（3）：553-555.
[8] 徐璐，汪涛，郭巧生，等.响应面法优化超声辅助法提取昆仑雪菊色素的工艺研究[J].中国中药杂志，2014，39（24）：4792-4797.
[9] 侯小涛，刘鹏，邓家刚，等.均匀设计优选甘蔗叶多糖颗粒制备工艺[J].中成药，2014，36（12）：2636-2639.
[10] 符少莲，冯翠娟，李沙.星点设计-效应面法优化脂溶性丹参提取物速释滴丸处方工艺[J].中成药，2013，35（4）：690-695.
（收稿日期：2016-04-28）
（修回日期：2016-05-17；编辑：陈静）