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摘要：目的分析结核分枝杆菌对利福平的耐药现况，为结核病的防治提供依据。方法采用直接涂片检查法和培养法，对肺结核病人的痰液进行检查，阳性标本经抗酸染色镜检确认后，采用绝对浓度法的间接法进行耐药性测定。结果131例疑似肺结核病人痰标本中，直接涂片法检出阳性标本21例，阳性检出率为16.0％(21／131)：培养法共检出阳性标本56例，阳性检出率为42.7％(56／131)。比较两种检测方法的阳性检出率，差异有显著性(P＜0.05)。培养法高于直接涂片法。将培养阳性标本进行利福平药物敏感性试验，其中有17株发生耐药，耐药率为30.4％(17／56)。结论结核杆菌对利福平的初始耐药率仍处在较高水平，必须进一步加强对耐药结核杆菌的监控。
关键词：结核分枝杆菌 福平 药敏试验
0 引言
全球80％的结核患者分布在22个结核病高负担国家，中国是其中之一，结核患者人数仅次于印度居世界第二位。但是，近10年来，临床上发现抗结核药的耐药性对结核病化疗效果的影响日益严重，尤其是利福平耐药的发生率不断上升给抗结核治疗带来较大的困难。为了解结核杆菌对利福平耐药的状况，为临床合理、联合用药提供依据，特作本研究。结果报告如下。
1 材料与方法
1.1病例来源某医院检查首次确诊为肺结核的病人，共131例。病例发病前均未服用过抗结核药物。结核分枝杆菌参考菌株为H37Rv敏感株，由中国结核病防治临床中心国家参比实验室提供。
1.2痰液直接涂片检查用接种环取脓性痰液1～2环，均匀涂于载玻片上，待自然干燥，微火焰固定，经抗酸染色后镜检。
1.3分枝杆菌培养
1.3.1培养基为酸性罗氏培养基。成分谷氨酸钠(纯度95％以上)7.2g，KH2PO4 14g，MgSO4·7H2O 0.24g，枸橼酸镁0.6g，甘油12mL，蒸馏水600mL，马铃薯淀粉30g，新鲜鸡卵液1000mL，2％孔雀绿水溶液20mL。
1.3.2制备方法各盐类成分溶解后，加马铃薯淀粉，混匀，沸水浴煮沸1h呈糊状(不时摇动，防凝块)，待冷后，加经消毒纱布过滤的新鲜鸡卵液，混匀，再加入2％孔雀绿水溶液，混匀，分装于经121℃高压灭菌的中型试管，每管加培养基约7mL，斜置血清凝固器内1～2层，斜面高度占试管2／3，90℃1.5h或85℃1h间歇2次。冷却后，37℃无菌试验24h。培养基斜面颜色鲜艳，表面光滑无泡，有一定韧性和酸碱缓冲能力，4℃保存，1个月内使用。
1.3.3接种方法取痰标本1～2mL，加入2倍量4％NaOH，于室温下放置30min(期间振荡2～3次)后，取处理消化后痰液0.1mL，无菌操作接种于培养基斜面上，每份标本同时接种2支酸性改良罗氏培养基，放置37℃恒温箱培养。每周观察1次，记录细菌生长情况，至8周为止。
1.4药敏试验具体操作参照结核病诊断细菌学检验规程。
1.4.1药物利福平由美国Sigma公司生产，北京索莱宝科技有限公司提供。为纯品，粉剂。
1.4.2培养基改良罗氏培养基。成分：谷氨酸钠(纯度95％以上)7.2g，KH2PO4 2.4g，MgSO4·7H2O 2.4g，枸橼酸镁0.6g，甘油12mL，蒸馏水600mL，马铃薯淀粉30g，新鲜鸡卵液1000mL，2％孔雀绿水溶液20mL。
1.4.3制备方法制备方法同酸性罗氏培养基，只是在培养基制成后分装于中型试管前，按每100mL培养基加入1mL利福平稀释药液，混匀，再行分装中型试管，加温凝固成斜面。
1.4.4利福平药液配制及稀释利福平药物为纯品，生物效价为1000ug／mg。参照文献，配制2个浓度的含药培养基，药物浓度为，50ug／mL、250ug／mL。根据痰培养阳性标本例数，每支试管含培养基7mL，计算所需培养基体积。每100mL培养基加入1mL利福平稀释药液。
1.4.5菌悬液的制备及接种方法参照《全国临床检验操作规程(第3版)》进行。
1.4.6质控每批药敏试验应以结核分枝杆菌参考菌株(H37Rv)检测含药培养基质量。
1.4.7结果判定对照培养基菌落数必须在200以上且无融合。若菌落数低于50时，重新做药物敏感性测定。
(一)：培养基斜面上无分枝杆菌菌落生长。
(1+)：菌落数约占斜面面积的1／4。
(2+)：菌落数约占斜面面积的1／2。
(3+)：菌落数约占斜面面积的3／4。
(4+)：菌落呈菌苔样生长。
菌落数少于20个时，报告菌落数。含药培养基菌落数少于20个时，当作不生长。低浓度含药培养基上生长的菌落数多于20个时，即可判定为耐药。低浓度生长、高浓度不生长为中度耐药；高、低浓度均生长为高度耐药。
2 结果
2.1痰涂片情况131例肺结核病人标本中，共有21例痰涂片为阳性，阳性率为16.0％。
2.2痰培养情况131例标本中，经培养有菌生长且经抗酸染色镜检后，共有56例确定为结核分枝杆菌，阳性检出率为42.7％。两种检测方法其阳性检出率比较，差异有显著性(P＜0.05)。培养法高干直接涂片法。
2.3药敏试验结果质控H37Rv生长情况：对照培养基为4+，高、低浓度含药培养基均不生长，为敏感。故所配制的培养基质量合格，能用于药物敏感性测试。
56株痰培养阳性标本中，共有17株出现耐药，总耐药率为30.3％，其中，属中度耐药有10株，耐药率为17.8％，属高度耐药有7株，耐药率为12.5％。
3 讨论
直接涂片检查法和分枝杆菌培养法是结核病实验室诊断中常用的2种方法，2种方法的阳性检出率对结核病实验室诊断有重要影响。本研究中培养法阳性检出率高于直接涂片检查法。因此，临床上可将2种方法结合使用，以提高结核菌的阳性检出率。
耐药性试验不仅是临床选择和评价化疗方案的依据，更是流行病学的重要指标。我国于2000年开展了第4次全国结核病流行病学抽样调查，结果显示，利福平耐药的初始耐药率为10.3％，本研究中利福平敏感性试验初始耐药率为30.3％，比全国流行病学调查测出的耐药率要高；与其他省份耐药情况相比，湖北省的研究显示结核杆菌对利福平的初始耐药率为3.8％，福建省的为9.5％，本研究中利福平初始耐药率高于该两省：与广东省内其他城市相比，深圳市利福平初始耐药率为7.7％，东莞地区为7.5％，本次药敏实验利福平初始耐药率也均高于两市的研究结果。
利福平自1971年发明以来，一直是结核化疗方案中的一个关键药物。特别在短程化疗中起着重要作用。而对利福平的耐药意味着一方面由于患者对利福平耐药，临床上须加大用药剂量或改用其他抗结核药物，使患者的疗程延长，增加患者的危险和经济负担：另一方面扩大耐药性传播的机会，使得总体人群暴露于耐药结核杆菌的危险性增加。
研究表明，利福平产生耐药性是由于其作用靶分子RNA多聚酶亚单位的编码基因(rpoB)突变所致。由于结核分枚杆菌产生自然耐药变异的频率很低，造成耐药的主要原因是治疗过程中不合理的联合用药、间断用药、不执行归口管理与治疗等。因此，在今后的结核病防治工作中，重点为社会性综合防治措施，抓好结核病人的发现、登记、管理和合理治疗。坚持在直接面视短程化疗(DOTS)下，早期、适量、规律、全程、联合应用敏感药物或抗结核药物复合剂，辅以免疫剂治疗，使得在强化期内迅速、大量杀灭结核菌，使痰菌转阴。对于耐药病例防治，须坚持联合用药的原则，根据既往用药史和药物敏感性试验制定个体化治疗方案。结核病防治有关部门也应加强对耐药菌株的检测，掌握结核病耐药趋势，以指导临床合理、有效用药。
关键词：结核分枝杆菌 福平 药敏试验
0 引言
全球80％的结核患者分布在22个结核病高负担国家，中国是其中之一，结核患者人数仅次于印度居世界第二位。但是，近10年来，临床上发现抗结核药的耐药性对结核病化疗效果的影响日益严重，尤其是利福平耐药的发生率不断上升给抗结核治疗带来较大的困难。为了解结核杆菌对利福平耐药的状况，为临床合理、联合用药提供依据，特作本研究。结果报告如下。
1 材料与方法
1.1病例来源某医院检查首次确诊为肺结核的病人，共131例。病例发病前均未服用过抗结核药物。结核分枝杆菌参考菌株为H37Rv敏感株，由中国结核病防治临床中心国家参比实验室提供。
1.2痰液直接涂片检查用接种环取脓性痰液1～2环，均匀涂于载玻片上，待自然干燥，微火焰固定，经抗酸染色后镜检。
1.3分枝杆菌培养
1.3.1培养基为酸性罗氏培养基。成分谷氨酸钠(纯度95％以上)7.2g，KH2PO4 14g，MgSO4·7H2O 0.24g，枸橼酸镁0.6g，甘油12mL，蒸馏水600mL，马铃薯淀粉30g，新鲜鸡卵液1000mL，2％孔雀绿水溶液20mL。
1.3.2制备方法各盐类成分溶解后，加马铃薯淀粉，混匀，沸水浴煮沸1h呈糊状(不时摇动，防凝块)，待冷后，加经消毒纱布过滤的新鲜鸡卵液，混匀，再加入2％孔雀绿水溶液，混匀，分装于经121℃高压灭菌的中型试管，每管加培养基约7mL，斜置血清凝固器内1～2层，斜面高度占试管2／3，90℃1.5h或85℃1h间歇2次。冷却后，37℃无菌试验24h。培养基斜面颜色鲜艳，表面光滑无泡，有一定韧性和酸碱缓冲能力，4℃保存，1个月内使用。
1.3.3接种方法取痰标本1～2mL，加入2倍量4％NaOH，于室温下放置30min(期间振荡2～3次)后，取处理消化后痰液0.1mL，无菌操作接种于培养基斜面上，每份标本同时接种2支酸性改良罗氏培养基，放置37℃恒温箱培养。每周观察1次，记录细菌生长情况，至8周为止。
1.4药敏试验具体操作参照结核病诊断细菌学检验规程。
1.4.1药物利福平由美国Sigma公司生产，北京索莱宝科技有限公司提供。为纯品，粉剂。
1.4.2培养基改良罗氏培养基。成分：谷氨酸钠(纯度95％以上)7.2g，KH2PO4 2.4g，MgSO4·7H2O 2.4g，枸橼酸镁0.6g，甘油12mL，蒸馏水600mL，马铃薯淀粉30g，新鲜鸡卵液1000mL，2％孔雀绿水溶液20mL。
1.4.3制备方法制备方法同酸性罗氏培养基，只是在培养基制成后分装于中型试管前，按每100mL培养基加入1mL利福平稀释药液，混匀，再行分装中型试管，加温凝固成斜面。
1.4.4利福平药液配制及稀释利福平药物为纯品，生物效价为1000ug／mg。参照文献，配制2个浓度的含药培养基，药物浓度为，50ug／mL、250ug／mL。根据痰培养阳性标本例数，每支试管含培养基7mL，计算所需培养基体积。每100mL培养基加入1mL利福平稀释药液。
1.4.5菌悬液的制备及接种方法参照《全国临床检验操作规程(第3版)》进行。
1.4.6质控每批药敏试验应以结核分枝杆菌参考菌株(H37Rv)检测含药培养基质量。
1.4.7结果判定对照培养基菌落数必须在200以上且无融合。若菌落数低于50时，重新做药物敏感性测定。
(一)：培养基斜面上无分枝杆菌菌落生长。
(1+)：菌落数约占斜面面积的1／4。
(2+)：菌落数约占斜面面积的1／2。
(3+)：菌落数约占斜面面积的3／4。
(4+)：菌落呈菌苔样生长。
菌落数少于20个时，报告菌落数。含药培养基菌落数少于20个时，当作不生长。低浓度含药培养基上生长的菌落数多于20个时，即可判定为耐药。低浓度生长、高浓度不生长为中度耐药；高、低浓度均生长为高度耐药。
2 结果
2.1痰涂片情况131例肺结核病人标本中，共有21例痰涂片为阳性，阳性率为16.0％。
2.2痰培养情况131例标本中，经培养有菌生长且经抗酸染色镜检后，共有56例确定为结核分枝杆菌，阳性检出率为42.7％。两种检测方法其阳性检出率比较，差异有显著性(P＜0.05)。培养法高干直接涂片法。
2.3药敏试验结果质控H37Rv生长情况：对照培养基为4+，高、低浓度含药培养基均不生长，为敏感。故所配制的培养基质量合格，能用于药物敏感性测试。
56株痰培养阳性标本中，共有17株出现耐药，总耐药率为30.3％，其中，属中度耐药有10株，耐药率为17.8％，属高度耐药有7株，耐药率为12.5％。
3 讨论
直接涂片检查法和分枝杆菌培养法是结核病实验室诊断中常用的2种方法，2种方法的阳性检出率对结核病实验室诊断有重要影响。本研究中培养法阳性检出率高于直接涂片检查法。因此，临床上可将2种方法结合使用，以提高结核菌的阳性检出率。
耐药性试验不仅是临床选择和评价化疗方案的依据，更是流行病学的重要指标。我国于2000年开展了第4次全国结核病流行病学抽样调查，结果显示，利福平耐药的初始耐药率为10.3％，本研究中利福平敏感性试验初始耐药率为30.3％，比全国流行病学调查测出的耐药率要高；与其他省份耐药情况相比，湖北省的研究显示结核杆菌对利福平的初始耐药率为3.8％，福建省的为9.5％，本研究中利福平初始耐药率高于该两省：与广东省内其他城市相比，深圳市利福平初始耐药率为7.7％，东莞地区为7.5％，本次药敏实验利福平初始耐药率也均高于两市的研究结果。
利福平自1971年发明以来，一直是结核化疗方案中的一个关键药物。特别在短程化疗中起着重要作用。而对利福平的耐药意味着一方面由于患者对利福平耐药，临床上须加大用药剂量或改用其他抗结核药物，使患者的疗程延长，增加患者的危险和经济负担：另一方面扩大耐药性传播的机会，使得总体人群暴露于耐药结核杆菌的危险性增加。
研究表明，利福平产生耐药性是由于其作用靶分子RNA多聚酶亚单位的编码基因(rpoB)突变所致。由于结核分枚杆菌产生自然耐药变异的频率很低，造成耐药的主要原因是治疗过程中不合理的联合用药、间断用药、不执行归口管理与治疗等。因此，在今后的结核病防治工作中，重点为社会性综合防治措施，抓好结核病人的发现、登记、管理和合理治疗。坚持在直接面视短程化疗(DOTS)下，早期、适量、规律、全程、联合应用敏感药物或抗结核药物复合剂，辅以免疫剂治疗，使得在强化期内迅速、大量杀灭结核菌，使痰菌转阴。对于耐药病例防治，须坚持联合用药的原则，根据既往用药史和药物敏感性试验制定个体化治疗方案。结核病防治有关部门也应加强对耐药菌株的检测，掌握结核病耐药趋势，以指导临床合理、有效用药。