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摘 要 以单子叶植物常见外源转基因元件Ubiquitin启动子、NOS启动子、NOS终止子、Bar基因和Bt基因序列设计多重PCR引物，通过对PCR扩增体系中退火温度、Premix TaqTM浓度、引物浓度的优化，建立一种快速检测转基因甘蔗成分的多重PCR方法。结果表明：建立的体系一次能有效检测5个参数，其检测的最低DNA质量百分比可达1.0%，并在多个转基因甘蔗品种检测中得到验证。
关键词 多重PCR；甘蔗；转基因检测
中图分类号 S566.1 文献标识码 A
自20世纪80年代获得第一例转基因植株以来，转基因作物的种植面积迅速扩大。据国际农业生物技术推广与应用协会（ISAAA）统计，2012年全球28个国家的1 730万农民种植转基因作物1.7亿hm2，其中中国种植面积达400万hm2，全球排名第六[1]。甘蔗（Saccharum Complex）是最主要的糖料作物， 蔗糖占世界食糖总产量的76%，占中国食糖总产量的90%以上[2-3]。目前转基因技术已广泛应用于甘蔗的遗传育种，2011年高世武等[4]通过PPT筛选得到了转Bt基因（抗螟虫）和Bar基因（抗除草剂）的双抗转基因甘蔗。2012年董丽莎等[5]根据甘蔗黄叶病毒CP基因构建RNAi载体，并成功转化甘蔗。然而，随着《农业转基因生物安全管理条例》的出台[6]，转基因检测的方法越来越受到广泛关注。
对于转基因生物的检测，目前国内外实验室和检测部门应用最广泛的还是核酸PCR技术。对于具有多种外源基因元件序列的转基因生物，通常采用对每个元件进行一次PCR检测的方式，这样不仅耗时，而且也大幅度增加了检测的成本[7]。同时，为了避免多价转基因作物的多个外源基因之间产生“反式失活”[8]，人们在转基因作物育种中，一般采用避免使用相同启动子的做法[9]，这样又进一步增加了多抗转基因作物检测的靶序列。近年来，多重 PCR 技术在食品微生物和动物病原检测上已有相关报道[10-11]，同时在植物转基因检测方面也获得了一定的进展。2005年徐景升等[12]建立了检测转基因大豆的多重PCR体系，同年Forte等[13]用多重PCR技术检测大豆和玉米的外源基因；2008年高玉龙等[14]利用多重 PCR 技术成功检测到转基因烟草中的外源基因；2011年陈贞等[15]通过优化的多重PCR体系，成功检测出转基因菜籽粕中的外源基因；2013年徐方娇等[16]建立了检测转基因棉花的多重PCR体系；2013年邱良焱等[17]建立了检测转Bar、Bt基因双抗稻米的多重PCR体系。本实验室创制了转Bar基因和Bt基因双价转基因甘蔗[4]，在一个转化体中，同时含有Ubiquitin启动子、NOS启动子、NOS终止子、Bar基因和Bt基因序列，然而，一次同时检测这5个参数的多重PCR技术研究尚未见报道。为了提高PCR效率，市场上出现了用高保真Taq酶、PCR buffer和染料混合配制的2倍PCR反应液Premix TaqTM，PCR检测过程无需配制反应液和添加染料等步骤，节省了时间。如使用Premix TaqTM建立多重PCR技术，则可大幅度提高PCR检测的效率，但目前未见有相关研究报道。甘蔗属异源多倍体植物，由于染色体数目多且遗传机制十分复杂，转基因甘蔗的检测仍存在一定的难度，多重PCR技术在转基因甘蔗检测方面还未见报道。鉴于此，本实验以多价转基因甘蔗为材料，通过对影响多重PCR主要因素的优化，建立一种快速、高效的转基因甘蔗检测方法，以提高转基因甘蔗的检测效率，为转基因甘蔗的分子育种和检测提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
1.2.1 DNA提取 参照Biospin植物基因组DNA提取试剂盒说明书进行，柱洗脱产物转移至新的1.5 mL 离心管中，于-20 ℃保存备用。
1.2.2 DNA提取物质量的测定 用TU-1810PC型紫外分光光度计检测提取的DNA模板的浓度和纯度，A260 nm/A280 nm比值在1.7～2.0范围内的样品用于PCR检测模板，并将模板浓度调整到50 ng/μL[18]。
备用。
对照。
PCR反应体系：Premix TaqTM 15 μL， 上、 下游引物各0.6 μL， 模板3 μL（50 ng/μL），用ddH2O将终体积调整到30 μL。
PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸35 s，36个循环；72 ℃延伸10 min。取10 μL PCR扩增产物，用2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.5 多重PCR体系的优化 多重PCR反应体系参考Henegariu的方法[21]，PCR反应总体积为30 μL，模板为3 μL（50 ng/μL），以表2中各引物对按1 ∶ 1配比混合[22]。
不同Premix TaqTM含量与退火温度对多重PCR的影响：多重PCR反应中多种引物共用同一套模板，有多条扩增条带，Taq酶的用量较多；加上不同PCR引物的理论Tm值不同，因此Taq酶含量与退火温度是影响多重PCR反应的2个关键因素。为了确定合适的Premix TaqTM用量和多重PCR最适退火温度，本实验设计了40%、50%和60%共3种Premix TaqTM添加体积，并分别设立了60、58、56、55 ℃共4种退火温度，其余反应条件及电泳检测方法与1.2.4中相同。
不同Premix TaqTM含量与引物浓度对多重PCR的影响：多重PCR反应中不同引物共存于同一个反应体系中，共用同一套模板，Taq酶的用量与引物浓度也是影响多重PCR反应的2个重要因素。为探究不同Premix TaqTM含量和引物浓度对多重PCR的影响，本实验对40%、50%和60% 3种Premix TaqTM添加体积分别设立了0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L共5种引物浓度，其余反应条件及电泳检测方法与1.2.4中相同。 1.2.6 DNA模板含量对多重PCR体系的影响 多重PCR扩增的目的条带多，在优化后的多重PCR反应体系中，如果DNA模板含量过低，依然有可能影响检测结果。为确定多重PCR能检测的合适DNA量，将相同浓度的转基因株系FNSC15229与非转基因供体FN15的基因组DNA按不同体积比混合，使样品中转基因DNA质量百分比分别为3.0%、2.0%、1.0%、0.5%，以FNSC15229的基因组DNA为对照，进行多重PCR检测，根据目的条带的扩增情况判定合适DNA量。
1.2.7 多重PCR体系验证 为了验证所建立的多重PCR反应体系的可靠性，用已知外源目的基因元件的转基因甘蔗福农95-1702和桂糖94-119[4]及FNSC15229、FNSC22229和FNSC30229为材料，进行多重PCR检测，根据目的条带的扩增情况，判定建立的多重PCR反应体系的可靠性。
2 结果与分析
2.1 目的基因和调控因子单重PCR检测
利用表2中的PCR引物，以转基因甘蔗FNSC15229的DNA为模板，以非转基因甘蔗FN15为阴性对照，ddH2O为空白对照，分别进行Ubiquitin启动子、NOS启动子、NOS终止子、Bar基因和Bt基因PCR检测，结果各转基因元件均呈阳性，与已知的FNSC15229转基因成分一致。由图1可以看出，PCR产物特异性强，无可见的非特异条带，扩增效率高；与表1和表2对比可以看出，PCR检出的元件和产物大小都与预期的一致，这表明所设计的各引物均具有较好的特异性，可用于转基因的检测。同时将PCR扩增产物经测序和BLAST对比，扩增产物碱基序列与已知序列一致，证实PCR扩增产物确为目的扩增片段。
2.2 不同Premix TaqTM含量与退火温度对多重PCR的影响
2.3 不同Premix TaqTM含量与引物浓度对多重PCR的影响
2.4 DNA模板含量对多重PCR体系的影响
2.5 多重PCR体系验证
3 讨论与结论
本实验通过PCR反应组分优化，建立了可同时检测转基因甘蔗外源Bar基因、Bt基因、Ubiquitin启动子、NOS启动子和NOS终止子的5重PCR反应体系，确定了60%的Premix TaqTM添加体积比、0.3 μmol/L的各引物浓度、56 ℃的退火温度为5重PCR反应体系的最适条件。通过改变作为模板的转基因甘蔗基因组DNA的含量并利用已知转基因甘蔗为模板，对所建立的5重PCR反应体系进行验证，结果证明该PCR反应体系也适用于其它转基因甘蔗品系。上述5种转基因成分检测中，转基因样品DNA质量百分比要求达到1.0%以上。
本实验对转基因研究中常见的外源调控因子Ubiquitin启动子、NOS启动子、NOS终止子及外源基因Bar和Bt建立了5重PCR体系，尤其是Ubiquitin启动子在单子叶植物转基因研究中经常使用，因此本方法在单子叶植物转基因检测中更有优势；虽然目前有见含Ubiquitin启动子的多重PCR方法，但需要进行2次多重PCR方法才能完成[17]，本体系只需1次PCR反应就能完成5种常见转基因元件的检测，有更高的实用价值。
多重PCR是在同一反应体系中加入多对引物，获得多个片段的特异性扩增。因此，引物组合设计时，应尽量控制各引物间的Tm值，以便更好设计PCR的退火温度。本实验使用的检测引物中，Bar基因检测引物参照进出口检验检疫行业标准[20]，Ubiquitin启动子参照本实验室的研究结果[19]，而NOS启动子参照农业部颁布的转基因检测国家标准[23]，但为了PCR扩增片段相互分开，引物序列有调整。其余引物均由本实验自行设计。
在建立多重PCR反应体系过程中，即使使用同样的DNA模板，并在优化的条件下，各目的条带扩增效果仍然达不到进行单对引物PCR反应时各目的条带扩增的均一性，说明多重PCR反应中各对引物之间存在复杂的竞争关系。
参考文献
[1] Clive J. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops[M]. ISAAA，2012.
[2] Andr L V， Felipe R S， Edson L K， et al. Analysis and functional annotation of an expressed sequence tag collection for tropical crop sugarcane[J]. Genome Res， 2003， 13： 2 725-2 735.
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[4] 高世武， 郭晋隆， 许莉萍，等. 基因枪法获得转cry1Ac基因甘蔗的研究[J]. 热带农业科学， 2011， 31（2）： 142-148.
[5] 董丽莎. 甘蔗黄叶病毒CP基因RNAi载体的构建及转化甘蔗研究[J]. 海口： 海南大学， 2012： 5.
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[11] 黄溢泓， 韦正吉， 李志源，等. 多重PCR技术在动物病原检测中的应用[J]. 广西农业科学， 2009， 40（4）： 423-425.
[12] 徐景升， 余爱丽， 姚 伟， 等. 利用MPCR技术快速检测进口大豆转基因背景[J]. 江西农业大学学报， 2005， 40（4）： 423-425.
[13] Forte V T， Pinto A D， Martino C， et al. A general multiplex-PCR assay for the general detection of genetically modified soya and maize[J]. Food Control， 2005， 16（6）： 535-539.
[14] 高玉龙， 焦芳婵， 徐照丽，等. 多重PCR在烟草转基因检测中的应用[J]. 生物技术通报， 2008（2）： 140-142.
[15] 陈 贞， 芦春斌， 杨梦婕，等. 多重PCR检测转基因菜籽粕中的转基因成分[J]. 植物检疫， 2011， 25（3）： 35-38.
[16] 徐方娇， 冯俊丽， 梁 颖，等. 转基因棉花中棉41多重PCR体系的建立[J]. 科技通报， 2013， 29（3）： 51-57.
[17] 邱良焱， 肖有玉， 刘 佳， 等. 多重PCR法检测转Bar、 Bt基因双抗稻米[J]. 食品科学， 2013， 34（6）： 139-142.
[18] Keeratipibul S， Luangsakul N， Lertsatchayarn T. The effect of Thai glutinous rice cultivars，grain length and cultivating locations on the quality of rice cracker（arare）[J]. Food Science and Technology， 2008， 41（10）： 1 934-1 943.
[19] 高世武. Cry1AC基因遗传转化甘蔗研究[D]. 毕业论文， 2008：16-17.
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[22] 魏 霜， 陈 贞， 芦春斌，等. 多重PCR检测转基因水稻的转基因成分[J]. 食品科学， 2012， 33（12）： 159-162.
[23] 中华人民共和国国家标准. 转基因植物及其产品成分检测调控原件CaMV 35S启动子， FMV 35S启动子、 NOS启动子、 NOS终止子和CaMV 35S终止子定性PCR方法[S]. 农业部1782号公告-3-2012， 2012： 7.
责任编辑：黄东杰
关键词 多重PCR；甘蔗；转基因检测
中图分类号 S566.1 文献标识码 A
自20世纪80年代获得第一例转基因植株以来，转基因作物的种植面积迅速扩大。据国际农业生物技术推广与应用协会（ISAAA）统计，2012年全球28个国家的1 730万农民种植转基因作物1.7亿hm2，其中中国种植面积达400万hm2，全球排名第六[1]。甘蔗（Saccharum Complex）是最主要的糖料作物， 蔗糖占世界食糖总产量的76%，占中国食糖总产量的90%以上[2-3]。目前转基因技术已广泛应用于甘蔗的遗传育种，2011年高世武等[4]通过PPT筛选得到了转Bt基因（抗螟虫）和Bar基因（抗除草剂）的双抗转基因甘蔗。2012年董丽莎等[5]根据甘蔗黄叶病毒CP基因构建RNAi载体，并成功转化甘蔗。然而，随着《农业转基因生物安全管理条例》的出台[6]，转基因检测的方法越来越受到广泛关注。
对于转基因生物的检测，目前国内外实验室和检测部门应用最广泛的还是核酸PCR技术。对于具有多种外源基因元件序列的转基因生物，通常采用对每个元件进行一次PCR检测的方式，这样不仅耗时，而且也大幅度增加了检测的成本[7]。同时，为了避免多价转基因作物的多个外源基因之间产生“反式失活”[8]，人们在转基因作物育种中，一般采用避免使用相同启动子的做法[9]，这样又进一步增加了多抗转基因作物检测的靶序列。近年来，多重 PCR 技术在食品微生物和动物病原检测上已有相关报道[10-11]，同时在植物转基因检测方面也获得了一定的进展。2005年徐景升等[12]建立了检测转基因大豆的多重PCR体系，同年Forte等[13]用多重PCR技术检测大豆和玉米的外源基因；2008年高玉龙等[14]利用多重 PCR 技术成功检测到转基因烟草中的外源基因；2011年陈贞等[15]通过优化的多重PCR体系，成功检测出转基因菜籽粕中的外源基因；2013年徐方娇等[16]建立了检测转基因棉花的多重PCR体系；2013年邱良焱等[17]建立了检测转Bar、Bt基因双抗稻米的多重PCR体系。本实验室创制了转Bar基因和Bt基因双价转基因甘蔗[4]，在一个转化体中，同时含有Ubiquitin启动子、NOS启动子、NOS终止子、Bar基因和Bt基因序列，然而，一次同时检测这5个参数的多重PCR技术研究尚未见报道。为了提高PCR效率，市场上出现了用高保真Taq酶、PCR buffer和染料混合配制的2倍PCR反应液Premix TaqTM，PCR检测过程无需配制反应液和添加染料等步骤，节省了时间。如使用Premix TaqTM建立多重PCR技术，则可大幅度提高PCR检测的效率，但目前未见有相关研究报道。甘蔗属异源多倍体植物，由于染色体数目多且遗传机制十分复杂，转基因甘蔗的检测仍存在一定的难度，多重PCR技术在转基因甘蔗检测方面还未见报道。鉴于此，本实验以多价转基因甘蔗为材料，通过对影响多重PCR主要因素的优化，建立一种快速、高效的转基因甘蔗检测方法，以提高转基因甘蔗的检测效率，为转基因甘蔗的分子育种和检测提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
1.2.1 DNA提取 参照Biospin植物基因组DNA提取试剂盒说明书进行，柱洗脱产物转移至新的1.5 mL 离心管中，于-20 ℃保存备用。
1.2.2 DNA提取物质量的测定 用TU-1810PC型紫外分光光度计检测提取的DNA模板的浓度和纯度，A260 nm/A280 nm比值在1.7～2.0范围内的样品用于PCR检测模板，并将模板浓度调整到50 ng/μL[18]。
备用。
对照。
PCR反应体系：Premix TaqTM 15 μL， 上、 下游引物各0.6 μL， 模板3 μL（50 ng/μL），用ddH2O将终体积调整到30 μL。
PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸35 s，36个循环；72 ℃延伸10 min。取10 μL PCR扩增产物，用2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.5 多重PCR体系的优化 多重PCR反应体系参考Henegariu的方法[21]，PCR反应总体积为30 μL，模板为3 μL（50 ng/μL），以表2中各引物对按1 ∶ 1配比混合[22]。
不同Premix TaqTM含量与退火温度对多重PCR的影响：多重PCR反应中多种引物共用同一套模板，有多条扩增条带，Taq酶的用量较多；加上不同PCR引物的理论Tm值不同，因此Taq酶含量与退火温度是影响多重PCR反应的2个关键因素。为了确定合适的Premix TaqTM用量和多重PCR最适退火温度，本实验设计了40%、50%和60%共3种Premix TaqTM添加体积，并分别设立了60、58、56、55 ℃共4种退火温度，其余反应条件及电泳检测方法与1.2.4中相同。
不同Premix TaqTM含量与引物浓度对多重PCR的影响：多重PCR反应中不同引物共存于同一个反应体系中，共用同一套模板，Taq酶的用量与引物浓度也是影响多重PCR反应的2个重要因素。为探究不同Premix TaqTM含量和引物浓度对多重PCR的影响，本实验对40%、50%和60% 3种Premix TaqTM添加体积分别设立了0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L共5种引物浓度，其余反应条件及电泳检测方法与1.2.4中相同。 1.2.6 DNA模板含量对多重PCR体系的影响 多重PCR扩增的目的条带多，在优化后的多重PCR反应体系中，如果DNA模板含量过低，依然有可能影响检测结果。为确定多重PCR能检测的合适DNA量，将相同浓度的转基因株系FNSC15229与非转基因供体FN15的基因组DNA按不同体积比混合，使样品中转基因DNA质量百分比分别为3.0%、2.0%、1.0%、0.5%，以FNSC15229的基因组DNA为对照，进行多重PCR检测，根据目的条带的扩增情况判定合适DNA量。
1.2.7 多重PCR体系验证 为了验证所建立的多重PCR反应体系的可靠性，用已知外源目的基因元件的转基因甘蔗福农95-1702和桂糖94-119[4]及FNSC15229、FNSC22229和FNSC30229为材料，进行多重PCR检测，根据目的条带的扩增情况，判定建立的多重PCR反应体系的可靠性。
2 结果与分析
2.1 目的基因和调控因子单重PCR检测
利用表2中的PCR引物，以转基因甘蔗FNSC15229的DNA为模板，以非转基因甘蔗FN15为阴性对照，ddH2O为空白对照，分别进行Ubiquitin启动子、NOS启动子、NOS终止子、Bar基因和Bt基因PCR检测，结果各转基因元件均呈阳性，与已知的FNSC15229转基因成分一致。由图1可以看出，PCR产物特异性强，无可见的非特异条带，扩增效率高；与表1和表2对比可以看出，PCR检出的元件和产物大小都与预期的一致，这表明所设计的各引物均具有较好的特异性，可用于转基因的检测。同时将PCR扩增产物经测序和BLAST对比，扩增产物碱基序列与已知序列一致，证实PCR扩增产物确为目的扩增片段。
2.2 不同Premix TaqTM含量与退火温度对多重PCR的影响
2.3 不同Premix TaqTM含量与引物浓度对多重PCR的影响
2.4 DNA模板含量对多重PCR体系的影响
2.5 多重PCR体系验证
3 讨论与结论
本实验通过PCR反应组分优化，建立了可同时检测转基因甘蔗外源Bar基因、Bt基因、Ubiquitin启动子、NOS启动子和NOS终止子的5重PCR反应体系，确定了60%的Premix TaqTM添加体积比、0.3 μmol/L的各引物浓度、56 ℃的退火温度为5重PCR反应体系的最适条件。通过改变作为模板的转基因甘蔗基因组DNA的含量并利用已知转基因甘蔗为模板，对所建立的5重PCR反应体系进行验证，结果证明该PCR反应体系也适用于其它转基因甘蔗品系。上述5种转基因成分检测中，转基因样品DNA质量百分比要求达到1.0%以上。
本实验对转基因研究中常见的外源调控因子Ubiquitin启动子、NOS启动子、NOS终止子及外源基因Bar和Bt建立了5重PCR体系，尤其是Ubiquitin启动子在单子叶植物转基因研究中经常使用，因此本方法在单子叶植物转基因检测中更有优势；虽然目前有见含Ubiquitin启动子的多重PCR方法，但需要进行2次多重PCR方法才能完成[17]，本体系只需1次PCR反应就能完成5种常见转基因元件的检测，有更高的实用价值。
多重PCR是在同一反应体系中加入多对引物，获得多个片段的特异性扩增。因此，引物组合设计时，应尽量控制各引物间的Tm值，以便更好设计PCR的退火温度。本实验使用的检测引物中，Bar基因检测引物参照进出口检验检疫行业标准[20]，Ubiquitin启动子参照本实验室的研究结果[19]，而NOS启动子参照农业部颁布的转基因检测国家标准[23]，但为了PCR扩增片段相互分开，引物序列有调整。其余引物均由本实验自行设计。
在建立多重PCR反应体系过程中，即使使用同样的DNA模板，并在优化的条件下，各目的条带扩增效果仍然达不到进行单对引物PCR反应时各目的条带扩增的均一性，说明多重PCR反应中各对引物之间存在复杂的竞争关系。
参考文献
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[16] 徐方娇， 冯俊丽， 梁 颖，等. 转基因棉花中棉41多重PCR体系的建立[J]. 科技通报， 2013， 29（3）： 51-57.
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责任编辑：黄东杰