论文部分内容阅读
摘 要 以24个橡胶树主栽品种为试材，从75对SSR引物中筛选到14对多态性引物，构建了24个品种的指纹图谱。结果每对引物可以检测到2～5个数目不等多态性等位基因，平均为4.00个等位基因，PIC 平均值为0.48。聚类分析可将24份主栽品种分为三大类，具有相同来源的多数品种聚为一类。24个橡胶品种的SSR指纹图谱互不相同，可以作为各品种的特定图谱。
关键词 橡胶树 ；SSR标记 ；聚类分析 ；品种鉴别
分类号 S794.1
巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）属大戟科（Euphobiaceae）橡胶树属（Hevea），是生产天然橡胶胶乳的主要树种。天然橡胶不仅是重要的工业原料，而且是一种重要的战略资源，在国民经济的发展中发挥着重要作用[1]。准确地鉴别巴西橡胶树品种或无性系，建立可靠的巴西橡胶树品种或无性系分类和鉴定体系具有重要意义。以往巴西橡胶树品种或无性系的分类与鉴定，仍延用1963年创立的以蜜腺、大叶枕、小叶柄、叶脉、叶形、株形等形态特征为基础的形态学鉴定方法，但形态鉴定易受形态性状的数量限制，多态性差、时间长，且容易受环境影响的特点[2]。特别是天然橡胶树栽培种质遗传基础狭窄，经50多年的近亲繁殖和选择育种，目前生产上使用的主栽品种形态差异较小，多数是全同胞或半同胞品种，仅用形态学很难进行区分。因此，建立一种快速、准确、有效的方法，用于橡胶树主栽品种鉴定，将有助于解决生产中品种鉴定难的问题。
DNA分子标记反映的是遗传本质上的差异，用于品种鉴定时具有周期短、不受环境条件影响、真实可靠等优点。随着分子生物学的不断发展，出现了多种DNA分子标记技术，如RAPD、RFLP、SSR、ISSR、AFLP等，其中SSR被认为是一种十分有效的分子标记技术，已被应用于评价遗传多样性、指纹图谱和绘制遗传图谱等各类巴西橡胶树研究中。华玉伟等[3]利用11 809条橡胶树ESTs，检索到258个SSR位点，最终筛选到40对具有多态性的SSR引物。谢黎黎等[4]从88对SSR标记中筛选5对，用于构建87 份橡胶树无性系的指纹图谱。冯素萍等[5]以热研88-13×IAN873 的94 个F1群体，建立了91个SSR标记的共18个连锁群，覆盖橡胶树基因组1 937.06 cM。李维国等[6]利用19 对引物对41 份橡胶树材料进行多态性检测，共获得92 个多态性位点， 每对引物检测到的等位基因数为2～7 个，平均为4.84 个。龙青姨等[7]利用25 对EST-SSRs 引物， 对中国热带农业科学院橡胶研究所国家橡胶树种质资源圃中保存的来自6 个国家的278 份魏克汉种质进行遗传多样性和遗传分化分析。Gouvêa等[8]对来自包括亚洲，非洲和亚马逊等60个橡胶树基因型遗传多样性， 利用68个多态性SSR标记，可将这些种质分为6组。Souza等[9]利用284个SSR标记构建23个连锁群，总长度为2 688.8 cM。
笔者利用已有的SSR分子标记对我国现有橡胶树主栽品种资源筛选高效SSR标记，构建指纹图谱并进行亲缘关系分析，以便为快速准确鉴定橡胶树品种提供技术支撑，对育成新品种进行有效保护具有十分重要的现实意义。
1 材料与方法
1.1 材料
本试验24个橡胶树主栽品种均取自中国热带农业科学院橡胶研究所国家橡胶树种质资源圃，材料具体名称见表1。
1.2 方法
1.2.1 总DNA的提取与检测
取变色期叶片，总DNA提取参照改良CTAB法[9]。取1 μL样品于1%的琼脂糖凝胶电泳检测，利用紫外分光光度计检测DNA纯度。
1.2.2 PCR扩增与检测
本研究所用的标记均来自于前人已开发的SSR标记，合成75对SSR引物[3-4，9]、PCR产物扩增、6%聚丙烯酰氨凝胶电泳、染色方法见Creste等[10]的研究。
1.2.3 数据分析与处理
SSR引物扩增每条多态性带视为1个等位基因位点，将观察到的每条带视为一个性状，有带时赋值为“1”，无带时赋值为“0”，建立数据库；用NTSYS-pc 2.10 e分析软件进行遗传相似性系数计算，并按UPMGA法进行聚类分析，构建树状系谱图。计算SSR位点的多态性信息量（PIC）。PIC=1-∑Pi2，其中Pi表示i位点的基因频率，利用Popgene软件计算香农指数（I）和基因多样性（GD）。
1.2.4 指纹图谱构建
将每个品种的SSR扩增产物所有谱带按扩增片段从小到大的顺序编号，用二位代码描述（依次为01、02……），对照参照品种的谱带确定待测样品的基因型。纯合位点的等位变异数据记录为XX，其中X为该位点谱带的代码；杂合位点的等位变异数据记录为XY，其中X、Y为该位点上2个不同的谱带。小片段在前，大片段在后。
2 结果与分析
2.1 SSR标记多态性分析
根据SSR扩增结果，每对引物检测的扩增位点数为2～10个，多态性位点数为2～5个，多态性比例为44.4%～100.0%（图1为标记SSR 39电泳图）。平均香农信息指数为0.95；基因多样性变幅为0.12～0.76，平均值为0.54；PIC值变幅为0.11～0.71，平均值为0.48。见表2。
2.2 指纹图谱构建
记录24个品种的SSR分子指纹图谱（表3）。
2.2 种质资源的遗传相似系数及聚类分析
根据SSR分子标记，统计不同基因型数据结果，利用NTSYS-pc V 2.10软件，采用UPGMA计算24个主栽品种两两间的遗传相似系数，得到相似系数矩阵。结果表明，24个主栽品种遗传相似系数次数分布图可知（图2），遗传相似性主要集中在0.55～0.80，占80%，近20%分布于两侧，说明天然橡胶的遗传性状差异较小，多样性较低。 根据24个主栽品种遗传相似系数矩阵，对品种进行聚类分析并建立聚类性状图（图3）。
以0.68为阈值，24份橡胶树品种可分为3类：第一类包括18份材料，第二类包括5份材料，第三类包括1份材料。通过对24个品种聚类分析发现，具有相同来源的多数品种聚为一类，如第一类中的多数品种（热研7-20-59、热研7-33-97、文昌11、保亭235、热研78-3-5、热研88-13、热研6-231）含RRIM600的遗传背景，与RRIM600聚在一起。含有GT1背景的云研77-2与GT1聚为一起，但也有例外，如含有PR107背景的湛试327-13，并未与PR107聚为一类。总之，遗传相似系数聚类分析结果基本上反映了品种之间的亲缘关系。
3 讨论
微卫星标记（SSR）由于具有多态性高、共显性、重复性好和特异性强等特点，已成为研究种质资源遗传多样性、指纹图谱构建的首选标记。刘冠明等[11]对南方花生主产区20个品种进行了SSR分析，并构建其指纹图谱，该图谱能将19个品种相互区分。Bredemeijer等[12]用20个SSR引物构建了500个马铃薯品种的DNA 指纹图谱，能准确地将其中的纯合品种鉴定出来。郭海林等[13]用2对引物建立了11个结缕草优良品系的DNA指纹图谱。本研究利用14对多态性SSR标记，对24份橡胶树主栽品种进行分析，这24份橡胶树主栽品种几乎涵盖了中国目前生产上使用的主栽品种。本研究建立的指纹数据库对橡胶树品种鉴定和品种保护具有理论和现实意义。
此外，遗传相似性次数分布图未呈正态分布，绝大部分遗传相似性集中在0.55～0.80，另有将近20%的相似性次数分布在两侧，说明橡胶树主栽群体遗传信息较为狭隘，遗传差异较小。橡胶树栽培种质都起源于魏克汉从原产地亚马逊河流域引种的野生种质，经过驯化形成了栽培品种，且育种工作者又往往选用生产性状比较优良的品种作亲本，这样，使很多品种之间的亲缘关系比较近，也使得橡胶树品种的遗传基础变得越来越狭窄。本实验的结果也恰恰证明了这一点。当遗传基础比较狭窄的群体遭遇较大自然灾害时，容易大面积受害。因此，深入了解橡胶树种质资源的遗传多样性，利于有针对性地选择杂交亲本，从而在实际选育种中选择亲缘关系较远的亲本
进行组配，有望获得较大的杂种优势，育成高产、抗寒的橡胶树新品种。
参考文献
[1] 梁荫东，郝秉中. 加强科技创新， 开拓我国天然橡胶产业发展新里程[J]. 热带农业科学，2005，25（2）：19-24.
[2] 农垦部热带作物科学研究院. 橡胶树无性系形态鉴定方法及图谱[M]. 北京：科学出版社社，1965.
[3] 华玉伟，卢 轶，龙青姨，等. 橡胶树EST-SSRs发掘研究[J]. 热带作物学报，2008，29（5）： 583-588.
[4] 谢黎黎，黄华孙，安泽伟，等. 基于SSR 标记的橡胶树无性系鉴定方法的建立[J]. 热带作物学报，2009，30（9）：1 314-1 319.
[5] 冯素萍，李维国，于 飞，等. 巴西橡胶树SSR 遗传图谱的构建[J]. 遗传，2010，32（8）：857-863.
[6] 李维国，冯素萍，郑学项，等. 用EST-SSR 标记分析巴西橡胶树的遗传多样性[J]. 热带作物学报，2009，30（12）：1 711-1 719.
[7] 龙青姨，华玉伟，高 战，等. 利用EST-SSRs标记分析巴西橡胶树魏克汉种质的遗传多样性及遗传分化[J]. 热带作物学报，2010，3（6）： 873-880.
[8] Gouvêa L R， Rubiano L B， Chioratto A F， et al. Genetic divergence of rubber tree estimated by multivariate techniques and microsatellite markers [J]. Genet Mol Biol， 2010， 33（2）： 308-318.
[9] Souza L M， Gazaffi R， Mantello C C， et al. QTL Mapping of Growth-Related Traits in a Full-Sib Family of Rubber Tree （Hevea brasiliensis） Evaluated in a Sub-Tropical Climate [J]. Plos one， 2013， 8（4） ： e 61 238.
[10] Creste S， Tulmann-Neto A， Figueira A. Detection of single sequence repeat polymorphisms in denaturing polyacrylamide sequencing gels by silver staining[J]. Plant Mol Biol Rep. 2001， 19（4）： 299-306.
[11] 刘冠明，郑奕雄，黎国良，等. 20个花生品种的SSR标记指纹图谱构建[J]. 中国农学通报，2006，22（6）：49-54.
[12] Bredemeijer M， Cooke J， Ganal W， et al. Construction and testing of a microsatellite database containing more than 500 tomato varieties[J]. Theor Appl Genet. 2002， 105（6-7）： 1 019-1 026.
[13] 郭海林，刘建秀，高 鹤，等. 结缕草属优良品系SSR 指纹图谱的构建[J]. 草业学报，2008，16（2）：53-59.
关键词 橡胶树 ；SSR标记 ；聚类分析 ；品种鉴别
分类号 S794.1
巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）属大戟科（Euphobiaceae）橡胶树属（Hevea），是生产天然橡胶胶乳的主要树种。天然橡胶不仅是重要的工业原料，而且是一种重要的战略资源，在国民经济的发展中发挥着重要作用[1]。准确地鉴别巴西橡胶树品种或无性系，建立可靠的巴西橡胶树品种或无性系分类和鉴定体系具有重要意义。以往巴西橡胶树品种或无性系的分类与鉴定，仍延用1963年创立的以蜜腺、大叶枕、小叶柄、叶脉、叶形、株形等形态特征为基础的形态学鉴定方法，但形态鉴定易受形态性状的数量限制，多态性差、时间长，且容易受环境影响的特点[2]。特别是天然橡胶树栽培种质遗传基础狭窄，经50多年的近亲繁殖和选择育种，目前生产上使用的主栽品种形态差异较小，多数是全同胞或半同胞品种，仅用形态学很难进行区分。因此，建立一种快速、准确、有效的方法，用于橡胶树主栽品种鉴定，将有助于解决生产中品种鉴定难的问题。
DNA分子标记反映的是遗传本质上的差异，用于品种鉴定时具有周期短、不受环境条件影响、真实可靠等优点。随着分子生物学的不断发展，出现了多种DNA分子标记技术，如RAPD、RFLP、SSR、ISSR、AFLP等，其中SSR被认为是一种十分有效的分子标记技术，已被应用于评价遗传多样性、指纹图谱和绘制遗传图谱等各类巴西橡胶树研究中。华玉伟等[3]利用11 809条橡胶树ESTs，检索到258个SSR位点，最终筛选到40对具有多态性的SSR引物。谢黎黎等[4]从88对SSR标记中筛选5对，用于构建87 份橡胶树无性系的指纹图谱。冯素萍等[5]以热研88-13×IAN873 的94 个F1群体，建立了91个SSR标记的共18个连锁群，覆盖橡胶树基因组1 937.06 cM。李维国等[6]利用19 对引物对41 份橡胶树材料进行多态性检测，共获得92 个多态性位点， 每对引物检测到的等位基因数为2～7 个，平均为4.84 个。龙青姨等[7]利用25 对EST-SSRs 引物， 对中国热带农业科学院橡胶研究所国家橡胶树种质资源圃中保存的来自6 个国家的278 份魏克汉种质进行遗传多样性和遗传分化分析。Gouvêa等[8]对来自包括亚洲，非洲和亚马逊等60个橡胶树基因型遗传多样性， 利用68个多态性SSR标记，可将这些种质分为6组。Souza等[9]利用284个SSR标记构建23个连锁群，总长度为2 688.8 cM。
笔者利用已有的SSR分子标记对我国现有橡胶树主栽品种资源筛选高效SSR标记，构建指纹图谱并进行亲缘关系分析，以便为快速准确鉴定橡胶树品种提供技术支撑，对育成新品种进行有效保护具有十分重要的现实意义。
1 材料与方法
1.1 材料
本试验24个橡胶树主栽品种均取自中国热带农业科学院橡胶研究所国家橡胶树种质资源圃，材料具体名称见表1。
1.2 方法
1.2.1 总DNA的提取与检测
取变色期叶片，总DNA提取参照改良CTAB法[9]。取1 μL样品于1%的琼脂糖凝胶电泳检测，利用紫外分光光度计检测DNA纯度。
1.2.2 PCR扩增与检测
本研究所用的标记均来自于前人已开发的SSR标记，合成75对SSR引物[3-4，9]、PCR产物扩增、6%聚丙烯酰氨凝胶电泳、染色方法见Creste等[10]的研究。
1.2.3 数据分析与处理
SSR引物扩增每条多态性带视为1个等位基因位点，将观察到的每条带视为一个性状，有带时赋值为“1”，无带时赋值为“0”，建立数据库；用NTSYS-pc 2.10 e分析软件进行遗传相似性系数计算，并按UPMGA法进行聚类分析，构建树状系谱图。计算SSR位点的多态性信息量（PIC）。PIC=1-∑Pi2，其中Pi表示i位点的基因频率，利用Popgene软件计算香农指数（I）和基因多样性（GD）。
1.2.4 指纹图谱构建
将每个品种的SSR扩增产物所有谱带按扩增片段从小到大的顺序编号，用二位代码描述（依次为01、02……），对照参照品种的谱带确定待测样品的基因型。纯合位点的等位变异数据记录为XX，其中X为该位点谱带的代码；杂合位点的等位变异数据记录为XY，其中X、Y为该位点上2个不同的谱带。小片段在前，大片段在后。
2 结果与分析
2.1 SSR标记多态性分析
根据SSR扩增结果，每对引物检测的扩增位点数为2～10个，多态性位点数为2～5个，多态性比例为44.4%～100.0%（图1为标记SSR 39电泳图）。平均香农信息指数为0.95；基因多样性变幅为0.12～0.76，平均值为0.54；PIC值变幅为0.11～0.71，平均值为0.48。见表2。
2.2 指纹图谱构建
记录24个品种的SSR分子指纹图谱（表3）。
2.2 种质资源的遗传相似系数及聚类分析
根据SSR分子标记，统计不同基因型数据结果，利用NTSYS-pc V 2.10软件，采用UPGMA计算24个主栽品种两两间的遗传相似系数，得到相似系数矩阵。结果表明，24个主栽品种遗传相似系数次数分布图可知（图2），遗传相似性主要集中在0.55～0.80，占80%，近20%分布于两侧，说明天然橡胶的遗传性状差异较小，多样性较低。 根据24个主栽品种遗传相似系数矩阵，对品种进行聚类分析并建立聚类性状图（图3）。
以0.68为阈值，24份橡胶树品种可分为3类：第一类包括18份材料，第二类包括5份材料，第三类包括1份材料。通过对24个品种聚类分析发现，具有相同来源的多数品种聚为一类，如第一类中的多数品种（热研7-20-59、热研7-33-97、文昌11、保亭235、热研78-3-5、热研88-13、热研6-231）含RRIM600的遗传背景，与RRIM600聚在一起。含有GT1背景的云研77-2与GT1聚为一起，但也有例外，如含有PR107背景的湛试327-13，并未与PR107聚为一类。总之，遗传相似系数聚类分析结果基本上反映了品种之间的亲缘关系。
3 讨论
微卫星标记（SSR）由于具有多态性高、共显性、重复性好和特异性强等特点，已成为研究种质资源遗传多样性、指纹图谱构建的首选标记。刘冠明等[11]对南方花生主产区20个品种进行了SSR分析，并构建其指纹图谱，该图谱能将19个品种相互区分。Bredemeijer等[12]用20个SSR引物构建了500个马铃薯品种的DNA 指纹图谱，能准确地将其中的纯合品种鉴定出来。郭海林等[13]用2对引物建立了11个结缕草优良品系的DNA指纹图谱。本研究利用14对多态性SSR标记，对24份橡胶树主栽品种进行分析，这24份橡胶树主栽品种几乎涵盖了中国目前生产上使用的主栽品种。本研究建立的指纹数据库对橡胶树品种鉴定和品种保护具有理论和现实意义。
此外，遗传相似性次数分布图未呈正态分布，绝大部分遗传相似性集中在0.55～0.80，另有将近20%的相似性次数分布在两侧，说明橡胶树主栽群体遗传信息较为狭隘，遗传差异较小。橡胶树栽培种质都起源于魏克汉从原产地亚马逊河流域引种的野生种质，经过驯化形成了栽培品种，且育种工作者又往往选用生产性状比较优良的品种作亲本，这样，使很多品种之间的亲缘关系比较近，也使得橡胶树品种的遗传基础变得越来越狭窄。本实验的结果也恰恰证明了这一点。当遗传基础比较狭窄的群体遭遇较大自然灾害时，容易大面积受害。因此，深入了解橡胶树种质资源的遗传多样性，利于有针对性地选择杂交亲本，从而在实际选育种中选择亲缘关系较远的亲本
进行组配，有望获得较大的杂种优势，育成高产、抗寒的橡胶树新品种。
参考文献
[1] 梁荫东，郝秉中. 加强科技创新， 开拓我国天然橡胶产业发展新里程[J]. 热带农业科学，2005，25（2）：19-24.
[2] 农垦部热带作物科学研究院. 橡胶树无性系形态鉴定方法及图谱[M]. 北京：科学出版社社，1965.
[3] 华玉伟，卢 轶，龙青姨，等. 橡胶树EST-SSRs发掘研究[J]. 热带作物学报，2008，29（5）： 583-588.
[4] 谢黎黎，黄华孙，安泽伟，等. 基于SSR 标记的橡胶树无性系鉴定方法的建立[J]. 热带作物学报，2009，30（9）：1 314-1 319.
[5] 冯素萍，李维国，于 飞，等. 巴西橡胶树SSR 遗传图谱的构建[J]. 遗传，2010，32（8）：857-863.
[6] 李维国，冯素萍，郑学项，等. 用EST-SSR 标记分析巴西橡胶树的遗传多样性[J]. 热带作物学报，2009，30（12）：1 711-1 719.
[7] 龙青姨，华玉伟，高 战，等. 利用EST-SSRs标记分析巴西橡胶树魏克汉种质的遗传多样性及遗传分化[J]. 热带作物学报，2010，3（6）： 873-880.
[8] Gouvêa L R， Rubiano L B， Chioratto A F， et al. Genetic divergence of rubber tree estimated by multivariate techniques and microsatellite markers [J]. Genet Mol Biol， 2010， 33（2）： 308-318.
[9] Souza L M， Gazaffi R， Mantello C C， et al. QTL Mapping of Growth-Related Traits in a Full-Sib Family of Rubber Tree （Hevea brasiliensis） Evaluated in a Sub-Tropical Climate [J]. Plos one， 2013， 8（4） ： e 61 238.
[10] Creste S， Tulmann-Neto A， Figueira A. Detection of single sequence repeat polymorphisms in denaturing polyacrylamide sequencing gels by silver staining[J]. Plant Mol Biol Rep. 2001， 19（4）： 299-306.
[11] 刘冠明，郑奕雄，黎国良，等. 20个花生品种的SSR标记指纹图谱构建[J]. 中国农学通报，2006，22（6）：49-54.
[12] Bredemeijer M， Cooke J， Ganal W， et al. Construction and testing of a microsatellite database containing more than 500 tomato varieties[J]. Theor Appl Genet. 2002， 105（6-7）： 1 019-1 026.
[13] 郭海林，刘建秀，高 鹤，等. 结缕草属优良品系SSR 指纹图谱的构建[J]. 草业学报，2008，16（2）：53-59.