【摘 要】
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目的 构建电压门控性钠通道亚型Nav1.2 IQ片段及其癫痫突变体的质粒,制备高浓度和高纯度的体外重组蛋白并进行活性鉴定.方法 将Nav1.2IQ片段及癫痫突变体的cDNA插入pGEX-6p-1质粒载体后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,利用异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导Nav1.2IQ片段及癫痫突变体GST融合蛋白表达,GS-4B beads进行分离纯化.应用SDS-PAGE检测目的蛋白纯度和相对分子质量;采用Bradford方法测定GST蛋白浓度;应用pull-down法检测纯化后蛋白的活
【机 构】
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中国医科大学药学院药物毒理教研室,沈阳110122;沈阳二四二医院神经内分泌科,沈阳110034;中国医科大学药学院药物毒理教研室,沈阳,110122
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目的 构建电压门控性钠通道亚型Nav1.2 IQ片段及其癫痫突变体的质粒,制备高浓度和高纯度的体外重组蛋白并进行活性鉴定.方法 将Nav1.2IQ片段及癫痫突变体的cDNA插入pGEX-6p-1质粒载体后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,利用异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导Nav1.2IQ片段及癫痫突变体GST融合蛋白表达,GS-4B beads进行分离纯化.应用SDS-PAGE检测目的蛋白纯度和相对分子质量;采用Bradford方法测定GST蛋白浓度;应用pull-down法检测纯化后蛋白的活性.结果 Nav1.2IQ片段及其癫痫突变体在体外大肠杆菌中具有较高的纯度和表达量,与钙调蛋白在体外能够直接结合,证明制备的蛋白片段具有一定活性.结论 成功分离纯化了稳定高效的体外重组Nav1.2 IQ及其癫痫突变体蛋白,为研究Nav1.2与相关调节因子在癫痫发病的作用提供理论依据.
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