【摘 要】
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目的 研究FⅨArg327Ile (R327I)及Arg327 Ala(R327A)突变蛋白功能,探讨R327I突变导致血友病B的分子发病机制.方法 采用潮霉素筛选稳定表达细胞株,ELISA法筛选高效表达FⅨ重组蛋白细胞株,采用快流速Q琼脂糖凝胶和离子交换两步法分离纯化重组蛋白.ELISA和SDS-PAGE电泳分别检测重组蛋白含量和纯度.FⅦa/TF/Ca2+和FⅪa/Ca2+活化野生型及R327
【机 构】
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200025上海交通大学医学院附属瑞金医院上海血液学研究所医学基因组学国家重点实验室,200025上海交通大学医学院附属瑞金医院输血科,200025上海交通大学医学院附属瑞金医院上海血液学研究所医学基
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目的 研究FⅨArg327Ile (R327I)及Arg327 Ala(R327A)突变蛋白功能,探讨R327I突变导致血友病B的分子发病机制.方法 采用潮霉素筛选稳定表达细胞株,ELISA法筛选高效表达FⅨ重组蛋白细胞株,采用快流速Q琼脂糖凝胶和离子交换两步法分离纯化重组蛋白.ELISA和SDS-PAGE电泳分别检测重组蛋白含量和纯度.FⅦa/TF/Ca2+和FⅪa/Ca2+活化野生型及R327I和R327A突变FⅨ蛋白,用WB法分别检测不同时间内活化生成的FⅨa.野生型及两种突变FⅨa在不同FⅧa浓度下活化激活FX,以此计算野生型及两种突变FⅨa与FⅧa的解离常数；在含或不含FⅧa的条件下,检测野生型及两种突变FⅨa对不同浓度FX的激活能力,以此计算其催化效率.结果 表达分离纯化野生型、R327I和R327A FⅨ重组蛋白总量分别为450、210和64 μg,SDS-PAGE电泳结果显示重组蛋白纯度符合要求.两种突变蛋白均能被FⅦa/TF/Ca2+和FⅪa/Ca2+正常激活.R327I与R327A两种FⅨa突变蛋白与FⅧa的结合力分别为野生型的1/4和1/5.在含FⅧa条件下,R327I和R327I突变FⅨa对FX催化效率分别为野生型的1/6和1/8.而不含FⅧa条件下,催化效率分别为野生型的1/3和1/7.4.结论 R327I和R327A两种突变FⅨa与FⅧa结合异常,R327位点参与FⅧa结合,同时也与底物活化相关.R327I突变与FⅧa结合力降低导致重型血友病B的发生。
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