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【摘要】目的研究不同浓度的新疆黑蜂胶乙醇提取物对Balb/c小鼠淋巴细胞的增殖作用。方法新疆黑蜂胶经乙醇提取混合物，做倍比稀释。Balb/c小鼠脾淋巴细胞分别加入500μg/mL及倍比稀释至15.6μg/mL的黑蜂胶共6个测定浓度，同时设脂多糖对照组、刀豆蛋白A对照组和空白对照组。采用CCK-8测定不同浓度黑蜂胶在体外刺激脾淋巴细胞后的OD450值。结果500μg/mL至62.5μg/mL的黑蜂胶刺激小鼠淋巴细胞增殖的活性显著高于空白对照组（P<0.05），但低于ConA对照组（P<0.05）。黑蜂胶的免疫激活作用与其药物浓度呈正相关（r=0.794，P<0.05）。结论新疆黑蜂胶可非特异性的促进淋巴细胞显著增殖。
【关键词】新疆黑蜂胶；淋巴细胞；CCK-8
051文章编号：1004-7484（2014）-06-3045-02
蜂胶（Propolis）是医学宝库的古典名药，已有数千年的历吏。药理学研究发现，蜂胶具有多种生物作用.如抗菌、消炎、止痛、抗肿瘤等。而新疆黑蜂胶产自新疆，其是否也存在上述药效却很少见诸文献报道。研究新疆黑蜂胶调节小鼠淋巴细胞增殖作用，可明确新疆黑蜂胶所具有的天然免疫学活性效果。本研究采用cck-8法检测新疆黑蜂胶在体外对Balc/c小鼠脾淋巴细胞刺激48小时后淋巴细胞增殖活性，初步探讨其对淋巴细胞的免疫激活作用，对于有效的利用和开发这种新疆本土药物资源提供理论依据。
1资料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物Balb/c小鼠：雌雄兼用，体重（18±2.0）g（由新疆医科大学动物實验中心提供）。
1.1.2黑蜂胶混合物新疆黑蜂胶产品（来自新疆伊犁尼勒克县）
1.1.3实验仪器与试剂试剂：小鼠淋巴细胞分离液TBD货号：LTS1083；RPMI1640（Hyclone，美国，SH30809.01B）；CCK-8试剂（武汉博士德生物工程有限公司，AR1160）；豆蛋白（ConA）（Sigma195283；脂多糖（LPS）（SigmalL2630）95%无水乙醇。仪器：酶标仪（Bio-Rad公司）iMark；细胞计数仪（BioRad T10）恒温水浴箱等。
1.2方法
1.2.1获取新疆黑蜂胶提取物（以1000mL计）将粗蜂胶置于-20℃冰箱中过夜后用研钵粉碎；水浴法（m：v=1：8）除蜡；冷浸法提纯蜂胶，称取15g除蜡蜂胶，按照固液比1：5的比例，加75%乙醇75ml，封口浸泡两周；滤去沉渣，配制成100g/L蜂胶醇溶液，调整PH=7.0，使用0.2μm的无菌滤器过滤备用。
1.2.2制备小鼠脾细胞悬液颈椎脱臼法处死小鼠，无菌取脾脏置于培养皿中，用Hanks液冲洗，在含有4ml小鼠淋巴细胞分离液的200目尼龙网无菌培养皿中碾磨过滤，移至15ml离心管中，加入2ml1640培养液，分离淋巴细胞并加入PBS离心洗涤3次，加入0.83%的氯化胺到洗过的细胞中，静置5分钟，去除血红细胞，RPMI1640培养液洗涤细胞并配制细胞工作液为5×105/ml，加入96孔细胞培养板中，每孔100ul，细胞的终浓度为5×104/ml，边缘孔用无菌PBS填充，37℃，5%CO2培养2小时加药。
1.2.3实验分组研究分为不同浓度蜂胶刺激组、ConA对照组、LPS对照组和空白对照组。其中蜂胶刺激组根据刺激物的浓度分为500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.3μg/mL、15.6μg/mL共6个实验组，对照三个组，共9个实验组，每组25个复孔，每孔加不同浓度蜂胶刺激物和对照至脾细胞培养板。ConA对照组每孔加入10ul ConA（终浓度20ug/ml），LPS对照组每孔加入10ul LPS（终浓度1ug/ml），空白对照组加入10ul细胞培养液。置于37℃，5%CO2培养箱培养48小时。
1.2.4CCK-8检测法将48小时培养物每孔分别加入10ul CCK-8溶液后继续培养2小时，酶标仪检测OD值（波长450nm）（650nm作为参考波长进行双向测定），绘制细胞生长曲线，比较黑蜂胶各稀释浓度对体外淋巴细胞增殖作用的影响。
1.2.5数据分析将所得实验数据，采用SPSS18.0软件分析结果，数据均服从正态分布则采用均数士标准差（χ±s）进行统计描述，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。P<0.05说明差异有统计学意义。
2结果
2.1不同浓度新疆黑蜂胶刺激小鼠淋巴细胞增殖黑蜂胶各稀释浓度组与空白对照组相比，黑蜂胶浓度为500ug/mL至62.5ug/mL时，其刺激小鼠淋巴细胞增殖活性高于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05），而浓度低至31.3ug/mL则与空白对照无差异（P>0.05）。所有浓度的免疫刺激活性均显著低于ConA对照组（P<0.05）。与LPS对照相比，500ug/mL和250ug/mL的黑蜂胶表现出更强的免疫刺激活性（P<0.05），其余浓度均较低。
P<0.05）。
3讨论
蜂胶作为天然免疫刺激剂，能强化免疫系统，增强免疫细胞的活力，蜂胶可促进T、B淋巴细胞增殖，丰富的B细胞，可分泌特殊性抗体从而增强体液免疫，T细胞可强化机体的细胞免疫；蜂胶也可对骨髓、淋巴结等整个系统产生有益的影响。新疆黑蜂胶是集聚新疆本土特色的天然产品，它集聚多种生物学效应，是一种具有广泛开发前景的药物，新疆黑蜂胶是种天然混合物故易溶于有机溶剂，实时蜂胶的乙醇提取法是获取蜂胶中有效作用成分的简便易行的方法。
蜂胶研究进展相关文献显示蜂胶成分功效受地方差异影响，本课题组就新疆本土特色的天然产品黑蜂胶特异性免疫作用环节展开实验研究。将经过乙醇粗提的新疆黑蜂胶（1000μg/mL）按照1：2到1：64倍比稀释后，分别与Balb/C小鼠脾淋巴细胞混合孵育48小时，应用CCK-8试剂测定新疆黑蜂胶对小鼠脾淋巴细胞的体外激活和促进增殖的功能，同法检测ConA、LPS和细胞培养液对细胞的激活作用为本研究的对照，其中ConA为经典的T细胞丝裂原，LPS为经典的B细胞丝裂原，两者均可非特异性刺激靶细胞活化与增殖。检测结果显示一定浓度的新疆黑蜂胶可对淋巴细胞有体外激活作用，且其免疫活性与蜂胶浓度呈明显的正相关（r=0.853，P<0.05）。黑蜂胶各稀释浓度组与空白对照组相比，实验组黑蜂胶62.5μg/mL及以上浓度能显著提高小鼠脾脏T淋巴细胞增殖活性，与空白对照组相比差异有统计学意义。其中蜂胶浓度在250ug/mL以上时对B淋巴细胞的激活作用甚至高于LPS（P<0.05），提示新疆黑蜂胶对小鼠脾脏T/B淋巴细胞有较明显的体外激活和促进增殖作用。研究结果还提示各浓度蜂胶的功能均显著低于ConA（P<0.05），且蜂胶浓度低于31.3μg/mL时与空白对照没有统计学差异（P>0.05）。新疆黑蜂胶对淋巴细胞的激活作用存在明显的浓度依赖性，提示在淋巴细胞上可能存在识别黑蜂胶某些化学分子的受体。
新疆黑蜂胶促小鼠脾淋巴细胞增殖中T、B成分比重在本次试验结果并未得到充分体现，根据免疫学相关知识，T、B细胞都有相互促进生长分化的作用机制，而新疆黑蜂胶促小鼠淋巴细胞增殖的作用机理目前而不得而知，通过查证相关文献可以了解到相关方面的信息，诊谷用蜂胶给正常的小鼠经口灌胃，观察到蜂胶能明显增强ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖，转化能力。对于蜂胶药理活性的研究多种多样，蜂胶调节免疫功能的实验研究的形式多样，徐德洲等从细胞免疫.体液免疫，单核-巨噬细胞吞噬功能和NK细胞活性，其结果反映出蜂胶具有增强小鼠迟发型变态反应和小鼠淋巴细胞增殖能力，抗体生成细胞数，增强单核-巨噬细胞及NK细胞活性。而在庞阳康研究显示蜂胶能提高运动小鼠外周血CD4+T细胞百分比、CD4+/CD8+比值，而具有抵抗力竭游泳训练对T淋巴细胞免疫功能的抑制作用。关于蜂胶的研究最新进展对蜂胶生物学活性还在不断完善。本研究仅采用新疆黑蜂胶粗提制品，为了能够更好的利用新疆资源，分离出其有效成分，明确各成分的免疫激活和调节功能的机制则需要做更加深入的研究。
参考文献
[1]于英君.蜂胶的生物学活性与临床应用[J].中医药信息，2002，19（1）.
[2]褚亚芳，胡福良.蜂胶对淋巴细胞调节作用的研究进展[J].蜜蜂杂志，2009（05）.
[3]朱磊，李君，刘佩岩，张宁，周国忠，赵悦康，任立楠.蜂胶的药理作用研究[J].中国当代医药，2012（22）.
[4]张云香，杨志孝，安蔚，王家富，不同溶剂对蜂胶黄铜提取率影响的研究[J].时珍国医国药，2006，17（1）.
[5]徐德洲，吕中明，陈新霞.蜂胶增强小鼠免疫功能的实验研究[J].实用预防医学，2009.12，16（6）.
[6]庞阳康.蜂胶对力竭游泳运动的小鼠的免疫功能的影响[J].北京体育大学学报，2008，31（3）：353-355.
[7]聂坚，楚更五，张建莫.近5年蜂胶在医学领域的实验研究进展[J].云南中医中药杂志，2011，32（3）.
【关键词】新疆黑蜂胶；淋巴细胞；CCK-8
051文章编号：1004-7484（2014）-06-3045-02
蜂胶（Propolis）是医学宝库的古典名药，已有数千年的历吏。药理学研究发现，蜂胶具有多种生物作用.如抗菌、消炎、止痛、抗肿瘤等。而新疆黑蜂胶产自新疆，其是否也存在上述药效却很少见诸文献报道。研究新疆黑蜂胶调节小鼠淋巴细胞增殖作用，可明确新疆黑蜂胶所具有的天然免疫学活性效果。本研究采用cck-8法检测新疆黑蜂胶在体外对Balc/c小鼠脾淋巴细胞刺激48小时后淋巴细胞增殖活性，初步探讨其对淋巴细胞的免疫激活作用，对于有效的利用和开发这种新疆本土药物资源提供理论依据。
1资料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物Balb/c小鼠：雌雄兼用，体重（18±2.0）g（由新疆医科大学动物實验中心提供）。
1.1.2黑蜂胶混合物新疆黑蜂胶产品（来自新疆伊犁尼勒克县）
1.1.3实验仪器与试剂试剂：小鼠淋巴细胞分离液TBD货号：LTS1083；RPMI1640（Hyclone，美国，SH30809.01B）；CCK-8试剂（武汉博士德生物工程有限公司，AR1160）；豆蛋白（ConA）（Sigma195283；脂多糖（LPS）（SigmalL2630）95%无水乙醇。仪器：酶标仪（Bio-Rad公司）iMark；细胞计数仪（BioRad T10）恒温水浴箱等。
1.2方法
1.2.1获取新疆黑蜂胶提取物（以1000mL计）将粗蜂胶置于-20℃冰箱中过夜后用研钵粉碎；水浴法（m：v=1：8）除蜡；冷浸法提纯蜂胶，称取15g除蜡蜂胶，按照固液比1：5的比例，加75%乙醇75ml，封口浸泡两周；滤去沉渣，配制成100g/L蜂胶醇溶液，调整PH=7.0，使用0.2μm的无菌滤器过滤备用。
1.2.2制备小鼠脾细胞悬液颈椎脱臼法处死小鼠，无菌取脾脏置于培养皿中，用Hanks液冲洗，在含有4ml小鼠淋巴细胞分离液的200目尼龙网无菌培养皿中碾磨过滤，移至15ml离心管中，加入2ml1640培养液，分离淋巴细胞并加入PBS离心洗涤3次，加入0.83%的氯化胺到洗过的细胞中，静置5分钟，去除血红细胞，RPMI1640培养液洗涤细胞并配制细胞工作液为5×105/ml，加入96孔细胞培养板中，每孔100ul，细胞的终浓度为5×104/ml，边缘孔用无菌PBS填充，37℃，5%CO2培养2小时加药。
1.2.3实验分组研究分为不同浓度蜂胶刺激组、ConA对照组、LPS对照组和空白对照组。其中蜂胶刺激组根据刺激物的浓度分为500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.3μg/mL、15.6μg/mL共6个实验组，对照三个组，共9个实验组，每组25个复孔，每孔加不同浓度蜂胶刺激物和对照至脾细胞培养板。ConA对照组每孔加入10ul ConA（终浓度20ug/ml），LPS对照组每孔加入10ul LPS（终浓度1ug/ml），空白对照组加入10ul细胞培养液。置于37℃，5%CO2培养箱培养48小时。
1.2.4CCK-8检测法将48小时培养物每孔分别加入10ul CCK-8溶液后继续培养2小时，酶标仪检测OD值（波长450nm）（650nm作为参考波长进行双向测定），绘制细胞生长曲线，比较黑蜂胶各稀释浓度对体外淋巴细胞增殖作用的影响。
1.2.5数据分析将所得实验数据，采用SPSS18.0软件分析结果，数据均服从正态分布则采用均数士标准差（χ±s）进行统计描述，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。P<0.05说明差异有统计学意义。
2结果
2.1不同浓度新疆黑蜂胶刺激小鼠淋巴细胞增殖黑蜂胶各稀释浓度组与空白对照组相比，黑蜂胶浓度为500ug/mL至62.5ug/mL时，其刺激小鼠淋巴细胞增殖活性高于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05），而浓度低至31.3ug/mL则与空白对照无差异（P>0.05）。所有浓度的免疫刺激活性均显著低于ConA对照组（P<0.05）。与LPS对照相比，500ug/mL和250ug/mL的黑蜂胶表现出更强的免疫刺激活性（P<0.05），其余浓度均较低。
P<0.05）。
3讨论
蜂胶作为天然免疫刺激剂，能强化免疫系统，增强免疫细胞的活力，蜂胶可促进T、B淋巴细胞增殖，丰富的B细胞，可分泌特殊性抗体从而增强体液免疫，T细胞可强化机体的细胞免疫；蜂胶也可对骨髓、淋巴结等整个系统产生有益的影响。新疆黑蜂胶是集聚新疆本土特色的天然产品，它集聚多种生物学效应，是一种具有广泛开发前景的药物，新疆黑蜂胶是种天然混合物故易溶于有机溶剂，实时蜂胶的乙醇提取法是获取蜂胶中有效作用成分的简便易行的方法。
蜂胶研究进展相关文献显示蜂胶成分功效受地方差异影响，本课题组就新疆本土特色的天然产品黑蜂胶特异性免疫作用环节展开实验研究。将经过乙醇粗提的新疆黑蜂胶（1000μg/mL）按照1：2到1：64倍比稀释后，分别与Balb/C小鼠脾淋巴细胞混合孵育48小时，应用CCK-8试剂测定新疆黑蜂胶对小鼠脾淋巴细胞的体外激活和促进增殖的功能，同法检测ConA、LPS和细胞培养液对细胞的激活作用为本研究的对照，其中ConA为经典的T细胞丝裂原，LPS为经典的B细胞丝裂原，两者均可非特异性刺激靶细胞活化与增殖。检测结果显示一定浓度的新疆黑蜂胶可对淋巴细胞有体外激活作用，且其免疫活性与蜂胶浓度呈明显的正相关（r=0.853，P<0.05）。黑蜂胶各稀释浓度组与空白对照组相比，实验组黑蜂胶62.5μg/mL及以上浓度能显著提高小鼠脾脏T淋巴细胞增殖活性，与空白对照组相比差异有统计学意义。其中蜂胶浓度在250ug/mL以上时对B淋巴细胞的激活作用甚至高于LPS（P<0.05），提示新疆黑蜂胶对小鼠脾脏T/B淋巴细胞有较明显的体外激活和促进增殖作用。研究结果还提示各浓度蜂胶的功能均显著低于ConA（P<0.05），且蜂胶浓度低于31.3μg/mL时与空白对照没有统计学差异（P>0.05）。新疆黑蜂胶对淋巴细胞的激活作用存在明显的浓度依赖性，提示在淋巴细胞上可能存在识别黑蜂胶某些化学分子的受体。
新疆黑蜂胶促小鼠脾淋巴细胞增殖中T、B成分比重在本次试验结果并未得到充分体现，根据免疫学相关知识，T、B细胞都有相互促进生长分化的作用机制，而新疆黑蜂胶促小鼠淋巴细胞增殖的作用机理目前而不得而知，通过查证相关文献可以了解到相关方面的信息，诊谷用蜂胶给正常的小鼠经口灌胃，观察到蜂胶能明显增强ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖，转化能力。对于蜂胶药理活性的研究多种多样，蜂胶调节免疫功能的实验研究的形式多样，徐德洲等从细胞免疫.体液免疫，单核-巨噬细胞吞噬功能和NK细胞活性，其结果反映出蜂胶具有增强小鼠迟发型变态反应和小鼠淋巴细胞增殖能力，抗体生成细胞数，增强单核-巨噬细胞及NK细胞活性。而在庞阳康研究显示蜂胶能提高运动小鼠外周血CD4+T细胞百分比、CD4+/CD8+比值，而具有抵抗力竭游泳训练对T淋巴细胞免疫功能的抑制作用。关于蜂胶的研究最新进展对蜂胶生物学活性还在不断完善。本研究仅采用新疆黑蜂胶粗提制品，为了能够更好的利用新疆资源，分离出其有效成分，明确各成分的免疫激活和调节功能的机制则需要做更加深入的研究。
参考文献
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[4]张云香，杨志孝，安蔚，王家富，不同溶剂对蜂胶黄铜提取率影响的研究[J].时珍国医国药，2006，17（1）.
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