论文部分内容阅读
摘要：采用高效液相色谱法测定黑莓汁和黑莓果酒中有机酸含量。采用美国Agilent SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）为分析柱；流动相：0.5%（NH4）2HPO4-H3PO4缓冲液（磷酸调pH值为2.0）；温度：30 ℃；流速：1.0 mL/min；检测波长：214 nm；进样量：20 μL。建立了检测黑莓果酒中主要的6种有机酸（酒石酸、L-苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、D-苹果酸）的高效液相色谱方法。该方法的回收率为98.56%；RSD（相对标准偏差）为0.21%。
关键词：高效液相色谱法；黑莓汁；黑莓果酒；有机酸
中图分类号： O657.7 2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0327-03
黑莓（blackberry）属于蔷薇科（Rosaceae）悬钩子属小灌木Rubus laciniata的果实，是一种具有较强抗氧化能力的小浆果，美国农业部评价结果显示黑莓的抗氧化能力居第二位[1]。黑莓除含有糖、多种有机酸、膳食纤维、维生素和矿物质外，还含有大量的多酚、花青素、鞣花酸等具有抗氧化功能的成分[2-4]。我国黑莓的主栽品种有Hull、Chester、Boysen等，江苏、东北、贵州等地是我国主要的黑莓种植地区，总种植面积约1万hm2，全国黑莓年总产量约20万t。黑莓果实柔嫩多汁，营养丰富，富含锌、硒等多种矿物质，氨基酸种类齐全，且花色苷和总酚含量较高，被誉为第三代“黄金水果”，所含有的多酚类化合物在体内发挥抗氧化作用，可以降低心脏病、癌症和其他慢性病的发生率[3-4]。
糖和有机酸是食品中重要的风味成分。Türemi
瘙 塂 等研究了9种黑莓的糖酸比，结果发现黑莓最高的糖酸比（可溶性固形物含量/总酸）为9.6[5]。Wrolstad等采用气相色谱检测美国和英国多种黑莓中的有机酸，包括苹果酸、柠檬酸、莽草酸、异柠檬酸、奎宁酸和磷酸等，其中异柠檬酸是所有黑莓中含量最高的有机酸[6]。Kafkas等檢测了土耳其黑莓中的有机酸含量，在所研究的5种黑莓中，苹果酸是含量最高的酸，而柠檬酸的含量均为零[7]。糖和酸的比例（糖酸比）常被用来判断果实是否成熟和消费者的接受程度。如果是鲜食的品种，一定要保持适当的糖酸比。随着成熟度的增加，黑莓中可溶性固形物的含量增加，有机酸的含量减少。
植物体内有机酸含量分析是近几年来研究的热点，尤其是在逆境生理方面。果实中有机酸种类与含量也是衡量果实品质的重要指标。目前测定有机酸的方法通常包括气相色谱法、高效液相色谱法和离子色谱法，其中气相色谱法（GC）测定有机酸时，常常因为酸的沸点较高、不易气化而需要先对其衍生再进行测定，方法比较繁琐；离子色谱法（HPIC）是近来应用较多的测定植物体内有机酸的方法[8-9]，可以同时测定溶液中的有机酸根离子和无机阴离子，如NO-3、Cl-、PO43-等，并且样品前处理简单[10-12]，但大量无机阴离子的存在通常增加了低含量有机酸的检测难度；与之相比较，高效液相色谱法（HPLC）测定有机酸的方法比GC法简单[13-14]，但也存在pH值、流动相的选择等方面的问题，尤其是在测定几种以上的有机酸时更为明显。
对于黑莓果酒而言，同时检测多种有机酸是必须的，因为有机酸的组成和比例更直接地影响着黑莓果酒风味的优雅和谐，但由于黑莓果酒组分复杂，乙醇、色素、多酚以及糖等组分都可能对有机酸的检测造成干扰，因此，有必要建立一种稳定的、适于黑莓果酒多种有机酸分析的快速方法。
1 材料与方法
1.1 材料
黑莓果酒：江苏省农业科学院农产品加工研究所酿造的黑莓果酒，黑莓品种为宝森，采自南京溧水地区。
1.2 仪器与试剂
仪器：PHS-3C型pH值计（上海精密科学仪器有限公司）；Waters 2695-2998高效液相色谱仪（美国Waters公司），配有DAD检测器、色谱柱恒温箱和自动进样器；有机相针式过滤器。
试剂：酒石酸、L-苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、D-苹果酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；超纯水（电阻率为18.2 MΩ/cm2）；活性干酵母（湖北安琪酵母股份有限公司）。
1.3 有机酸标准液的配制
分别称取酒石酸、L-苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、D-苹果酸标准品50.0 mg，用去离子水定容至10 mL，配制成5 g/L标准液，为有机酸的混合标准样母液；临用时稀释为7个浓度梯度溶液。根据样品中有机酸含量分别稀释，经0.22 μm滤头过滤进样。以进样量（g/L）为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
1.4 样品的制备方法
1.4.1 黑莓汁的制备 黑莓→打浆→果胶酶酶解（45 ℃，4.5 h）→离心。
1.4.2 黑莓果酒的发酵 黑莓→打浆→果胶酶酶解（45 ℃，4.5 h）→调糖→接酵母菌（4%的蔗糖活化）→25 ℃发酵→黑莓果酒。
1.4.3 样液的制备 吸取5 mL黑莓汁和黑莓果酒，分别经11 000 r/min离心10 min，0.22 μm滤头过滤，待HPLC定量分析。
1.5 色谱条件
色谱柱：美国Agilent SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；流动相：0.5%（NH4）2HPO4-H3PO4缓冲液（磷酸调pH值为2.0），使用前用0.45 μm滤膜过滤；流速：1.0 mL/min；检测波长：214 nm；进样量：20 μL。
2 结果与分析
2.1 标准工作曲线的建立
分别吸取一定质量浓度的有机酸标准品，经0.22 μm滤膜过滤后进样。以进样量（g/L）为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得到标准曲线见表1。从图1可以看出色谱工作稳定，重现性良好。 2.2 流动相的选择
采用高效液相色谱法测定有机酸的研究很多，但是试验中所用的流动相种类及pH值有很大差别。常用的流动相有0.5%（NH4）2HPO4-H3PO4缓冲液（pH值2.5）[13-18]、甲醇 ∶ 15 mmol/L KH2PO4缓冲液（pH值2.1）=15 ∶ 85（体积比）[14]、0.6% KH2PO4（pH值2.65）[19]、4 mmol/L硫酸水溶液[20]等。通过对上述各流动相检测有机酸效果的比较，最终采用0.5%（NH4）2HPO4-H3PO4缓冲液（pH值 2.0）为流动相。
2.3 HPLC定量分析
试验选取不同浓度酒石酸、L-苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、D-苹果酸6种有机酸制作混合标准溶液，检测黑莓汁及黑莓果酒样品中的有机酸，结果（图1）表明，图中有8个主要的峰，其中峰1是溶剂峰，峰8是单宁，峰2、3、4、5、6、7分别是酒石酸、L-苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、D-苹果酸。
2.4 精密度试验
取6种有机酸标准品的混合溶液10 mL，经0.22 μm滤膜过滤后连续进样6次，分别计算有机酸峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），其平均RSD为0.18%（n=6）。表明该仪器灵敏度高，可用于黑莓汁和黑莓果酒中有机酸的检测。
2.5 重复性试验
精确吸取一定量的黑莓汁和黑莓果酒样品各6份，经离心、0.22 μm滤膜过滤后进样分析，分别计算有机酸峰面积的相对标准偏差，得到平均RSD为0.12%（n=6），表明该检测方法重现性良好。
2.6 加标回收率试验
采用加样回收法，精确吸取一定量的黑莓汁和黑莓果酒样品各5份，分别加入一定浓度的有机酸标准品，经离心、0.22 μm 滤膜过滤后进样检测，记录色谱图，根据峰面积计算回收率，结果见表2，其中有机酸平均回收率为98.56%，平均RSD为0.21%（n=5）。可见此方法的准确度和精密度均良好，可應用于黑莓汁和黑莓果酒中有机酸含量的检测。
3 讨论
HPLC法测定黑莓汁和黑莓果酒中的有机酸含量时，由于各种有机酸的洗脱速度相似，导致出峰时间相近，间隔较小，试验过程中通过调整流动相组成及配比达到了相对较好的分离效果。通过调整，（NH4）2HPO4-H3PO4缓冲液的浓度为0.5%、pH值为2.0的流动相，可达到较为理想的分离效果。
4 结论
采用色谱柱：美国Agilent SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；流动相：0.5%（NH4）2HPO4-H3PO4缓冲液（磷酸调pH值为2.0），使用前用0.45 μm滤膜过滤；流速：1.0 mL/min；紫外检测波长：214 nm；进样量：20 μL。通过该方法，黑莓汁和黑莓果酒中含有的6种主要有机酸得到分离并定量，其平均回收率为 98.56%，平均RSD为0.21%。结果显示，该方法操作简单，准确度高，无杂质干扰，黑莓汁和黑莓果酒样品无需经过复杂的前处理，即可达到较好的分离效果。
参考文献：
[1]Haytowitz D，Bhagwat S，Prior R，et al. Oxygen radical absorbance capacity（ORAC） of selected foods[R]. Nutrient Data Laboratory，Beltsville Human Nutrition Research Center，Agricultural Research Service and U.S. Departerment of Agricultural，2007.
[2]Siriwoharn T，Wrolstad R E，Finn C E，et al. Influence of cultivar，maturity，and sampling on blackberry （Rubus L. hybrids） anthocyanins，polyphenolics，and antioxidant properties[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52（26）：8021-8030.
[3]Bowen-Forbes C S，Zhang Y J，Nair M G. Anthocyanin content，antioxidant，anti-inflammatory and anticancer properties of blackberry and raspberry fruits[J]. Journal of Food Composition and Analysis，2010，23（6）：554-560.
[4]Elisia I，Hu C，Popovich D G，et al. Antioxidant assessment of an anthocyanin-enriched blackberry extract[J]. Food Chemistry，2007，101（3）：1052-1058.
[5]Türemi N，Kafkas S，Kafkas E，et al. Fruit characteristics of nine thornless blackberry genotypes[J]. Journal of American Pomological Society，2003，57（4）：161-165.
[6]Wrolstad R E，Culbertson J D，Nagaki D A，et al. Sugars and nonvolatile acids of blackberries[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1980，28（3）：553-558. [7]Kafkas E，Kosar M，Turemis N，et al. Analysis of sugars，organic acids and vitamin C contents of blackberry genotypes from Turkey[J]. Food Chemistry，2006，97（4）：732-736.
[8]牟世芬，蒋建萍，侯小平. 有机酸的离子排斥色谱分析研究[J]. 色谱，1992，10（3）：133-136.
[9]丁明玉，陈培榕，罗国安. 单一阴离子交换柱同时分离有机酸和无机阴阳离子[J]. 分析化学，1997，25（2）：161-164.
[10]沈 宏，严小龙，郑少玲，等. 菜豆有机酸和无机阴离子同时分析的离子色谱法[J]. 华南农业大学学报：自然科学版，2001，22（2）：8-10.
[11]郜志峰，傅承光. 单柱离子色谱同时分析有机酸和无机阴离子的研究[J]. 分析测试学报，1994，13（5）：32-36.
[12]刘克纳，沈冬青，等. 有机酸与无机阴离子的梯度离子色普法分析研究[J]. 色谱，1997，15（4）：334-337.
[13]鲁如坤. 土壤农业化学分析方法[M]. 北京：中国农业科学技术出版社，2000：463-473.
[14]赵景婵，郭治安，常建华，等. 有机酸类化合物的反相高效液相色谱法的分离条件研究[J]. 色谱，2001，19（3）：260-263.
[15]李海生，吴贵华. HPLC法用于北山楂和云南山楂中主要有机酸和维生素C的分析比较[J]. 中草药，1990，21（4）：13-14.
[16]林维宣，房学军，杨 红. 高效液相色谱法测定山楂中有机酸的研究[J]. 大連轻工业学院学报，1992，11（3/4）：21-24.
[17]成志强，孙成均，黎源倩. 反相高效液相色谱法同时测定食品和多维片中8种水溶性维生素[J]. 分析化学，2001，29（9）：1068-1071.
[18]李连朝，李天荣，汪沛洪. 反相HPLC测定食物中的有机酸[J]. 分析测试通报，1989，8（3）：21-26.
[19]陈文华，张 旸，李 鑫. 高效液相色谱法测定果酒中的有机酸[J]. 中国卫生检验杂志，2003，13（4）：454，453.
[20]毕丽君，张 骊，张鸿发. 固相萃取高效液相色普法分析酱油中的有机酸[J]. 分析化学，2000，28（11）：1391-1394.
关键词：高效液相色谱法；黑莓汁；黑莓果酒；有机酸
中图分类号： O657.7 2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0327-03
黑莓（blackberry）属于蔷薇科（Rosaceae）悬钩子属小灌木Rubus laciniata的果实，是一种具有较强抗氧化能力的小浆果，美国农业部评价结果显示黑莓的抗氧化能力居第二位[1]。黑莓除含有糖、多种有机酸、膳食纤维、维生素和矿物质外，还含有大量的多酚、花青素、鞣花酸等具有抗氧化功能的成分[2-4]。我国黑莓的主栽品种有Hull、Chester、Boysen等，江苏、东北、贵州等地是我国主要的黑莓种植地区，总种植面积约1万hm2，全国黑莓年总产量约20万t。黑莓果实柔嫩多汁，营养丰富，富含锌、硒等多种矿物质，氨基酸种类齐全，且花色苷和总酚含量较高，被誉为第三代“黄金水果”，所含有的多酚类化合物在体内发挥抗氧化作用，可以降低心脏病、癌症和其他慢性病的发生率[3-4]。
糖和有机酸是食品中重要的风味成分。Türemi
瘙 塂 等研究了9种黑莓的糖酸比，结果发现黑莓最高的糖酸比（可溶性固形物含量/总酸）为9.6[5]。Wrolstad等采用气相色谱检测美国和英国多种黑莓中的有机酸，包括苹果酸、柠檬酸、莽草酸、异柠檬酸、奎宁酸和磷酸等，其中异柠檬酸是所有黑莓中含量最高的有机酸[6]。Kafkas等檢测了土耳其黑莓中的有机酸含量，在所研究的5种黑莓中，苹果酸是含量最高的酸，而柠檬酸的含量均为零[7]。糖和酸的比例（糖酸比）常被用来判断果实是否成熟和消费者的接受程度。如果是鲜食的品种，一定要保持适当的糖酸比。随着成熟度的增加，黑莓中可溶性固形物的含量增加，有机酸的含量减少。
植物体内有机酸含量分析是近几年来研究的热点，尤其是在逆境生理方面。果实中有机酸种类与含量也是衡量果实品质的重要指标。目前测定有机酸的方法通常包括气相色谱法、高效液相色谱法和离子色谱法，其中气相色谱法（GC）测定有机酸时，常常因为酸的沸点较高、不易气化而需要先对其衍生再进行测定，方法比较繁琐；离子色谱法（HPIC）是近来应用较多的测定植物体内有机酸的方法[8-9]，可以同时测定溶液中的有机酸根离子和无机阴离子，如NO-3、Cl-、PO43-等，并且样品前处理简单[10-12]，但大量无机阴离子的存在通常增加了低含量有机酸的检测难度；与之相比较，高效液相色谱法（HPLC）测定有机酸的方法比GC法简单[13-14]，但也存在pH值、流动相的选择等方面的问题，尤其是在测定几种以上的有机酸时更为明显。
对于黑莓果酒而言，同时检测多种有机酸是必须的，因为有机酸的组成和比例更直接地影响着黑莓果酒风味的优雅和谐，但由于黑莓果酒组分复杂，乙醇、色素、多酚以及糖等组分都可能对有机酸的检测造成干扰，因此，有必要建立一种稳定的、适于黑莓果酒多种有机酸分析的快速方法。
1 材料与方法
1.1 材料
黑莓果酒：江苏省农业科学院农产品加工研究所酿造的黑莓果酒，黑莓品种为宝森，采自南京溧水地区。
1.2 仪器与试剂
仪器：PHS-3C型pH值计（上海精密科学仪器有限公司）；Waters 2695-2998高效液相色谱仪（美国Waters公司），配有DAD检测器、色谱柱恒温箱和自动进样器；有机相针式过滤器。
试剂：酒石酸、L-苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、D-苹果酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；超纯水（电阻率为18.2 MΩ/cm2）；活性干酵母（湖北安琪酵母股份有限公司）。
1.3 有机酸标准液的配制
分别称取酒石酸、L-苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、D-苹果酸标准品50.0 mg，用去离子水定容至10 mL，配制成5 g/L标准液，为有机酸的混合标准样母液；临用时稀释为7个浓度梯度溶液。根据样品中有机酸含量分别稀释，经0.22 μm滤头过滤进样。以进样量（g/L）为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
1.4 样品的制备方法
1.4.1 黑莓汁的制备 黑莓→打浆→果胶酶酶解（45 ℃，4.5 h）→离心。
1.4.2 黑莓果酒的发酵 黑莓→打浆→果胶酶酶解（45 ℃，4.5 h）→调糖→接酵母菌（4%的蔗糖活化）→25 ℃发酵→黑莓果酒。
1.4.3 样液的制备 吸取5 mL黑莓汁和黑莓果酒，分别经11 000 r/min离心10 min，0.22 μm滤头过滤，待HPLC定量分析。
1.5 色谱条件
色谱柱：美国Agilent SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；流动相：0.5%（NH4）2HPO4-H3PO4缓冲液（磷酸调pH值为2.0），使用前用0.45 μm滤膜过滤；流速：1.0 mL/min；检测波长：214 nm；进样量：20 μL。
2 结果与分析
2.1 标准工作曲线的建立
分别吸取一定质量浓度的有机酸标准品，经0.22 μm滤膜过滤后进样。以进样量（g/L）为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得到标准曲线见表1。从图1可以看出色谱工作稳定，重现性良好。 2.2 流动相的选择
采用高效液相色谱法测定有机酸的研究很多，但是试验中所用的流动相种类及pH值有很大差别。常用的流动相有0.5%（NH4）2HPO4-H3PO4缓冲液（pH值2.5）[13-18]、甲醇 ∶ 15 mmol/L KH2PO4缓冲液（pH值2.1）=15 ∶ 85（体积比）[14]、0.6% KH2PO4（pH值2.65）[19]、4 mmol/L硫酸水溶液[20]等。通过对上述各流动相检测有机酸效果的比较，最终采用0.5%（NH4）2HPO4-H3PO4缓冲液（pH值 2.0）为流动相。
2.3 HPLC定量分析
试验选取不同浓度酒石酸、L-苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、D-苹果酸6种有机酸制作混合标准溶液，检测黑莓汁及黑莓果酒样品中的有机酸，结果（图1）表明，图中有8个主要的峰，其中峰1是溶剂峰，峰8是单宁，峰2、3、4、5、6、7分别是酒石酸、L-苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、D-苹果酸。
2.4 精密度试验
取6种有机酸标准品的混合溶液10 mL，经0.22 μm滤膜过滤后连续进样6次，分别计算有机酸峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），其平均RSD为0.18%（n=6）。表明该仪器灵敏度高，可用于黑莓汁和黑莓果酒中有机酸的检测。
2.5 重复性试验
精确吸取一定量的黑莓汁和黑莓果酒样品各6份，经离心、0.22 μm滤膜过滤后进样分析，分别计算有机酸峰面积的相对标准偏差，得到平均RSD为0.12%（n=6），表明该检测方法重现性良好。
2.6 加标回收率试验
采用加样回收法，精确吸取一定量的黑莓汁和黑莓果酒样品各5份，分别加入一定浓度的有机酸标准品，经离心、0.22 μm 滤膜过滤后进样检测，记录色谱图，根据峰面积计算回收率，结果见表2，其中有机酸平均回收率为98.56%，平均RSD为0.21%（n=5）。可见此方法的准确度和精密度均良好，可應用于黑莓汁和黑莓果酒中有机酸含量的检测。
3 讨论
HPLC法测定黑莓汁和黑莓果酒中的有机酸含量时，由于各种有机酸的洗脱速度相似，导致出峰时间相近，间隔较小，试验过程中通过调整流动相组成及配比达到了相对较好的分离效果。通过调整，（NH4）2HPO4-H3PO4缓冲液的浓度为0.5%、pH值为2.0的流动相，可达到较为理想的分离效果。
4 结论
采用色谱柱：美国Agilent SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；流动相：0.5%（NH4）2HPO4-H3PO4缓冲液（磷酸调pH值为2.0），使用前用0.45 μm滤膜过滤；流速：1.0 mL/min；紫外检测波长：214 nm；进样量：20 μL。通过该方法，黑莓汁和黑莓果酒中含有的6种主要有机酸得到分离并定量，其平均回收率为 98.56%，平均RSD为0.21%。结果显示，该方法操作简单，准确度高，无杂质干扰，黑莓汁和黑莓果酒样品无需经过复杂的前处理，即可达到较好的分离效果。
参考文献：
[1]Haytowitz D，Bhagwat S，Prior R，et al. Oxygen radical absorbance capacity（ORAC） of selected foods[R]. Nutrient Data Laboratory，Beltsville Human Nutrition Research Center，Agricultural Research Service and U.S. Departerment of Agricultural，2007.
[2]Siriwoharn T，Wrolstad R E，Finn C E，et al. Influence of cultivar，maturity，and sampling on blackberry （Rubus L. hybrids） anthocyanins，polyphenolics，and antioxidant properties[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52（26）：8021-8030.
[3]Bowen-Forbes C S，Zhang Y J，Nair M G. Anthocyanin content，antioxidant，anti-inflammatory and anticancer properties of blackberry and raspberry fruits[J]. Journal of Food Composition and Analysis，2010，23（6）：554-560.
[4]Elisia I，Hu C，Popovich D G，et al. Antioxidant assessment of an anthocyanin-enriched blackberry extract[J]. Food Chemistry，2007，101（3）：1052-1058.
[5]Türemi N，Kafkas S，Kafkas E，et al. Fruit characteristics of nine thornless blackberry genotypes[J]. Journal of American Pomological Society，2003，57（4）：161-165.
[6]Wrolstad R E，Culbertson J D，Nagaki D A，et al. Sugars and nonvolatile acids of blackberries[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1980，28（3）：553-558. [7]Kafkas E，Kosar M，Turemis N，et al. Analysis of sugars，organic acids and vitamin C contents of blackberry genotypes from Turkey[J]. Food Chemistry，2006，97（4）：732-736.
[8]牟世芬，蒋建萍，侯小平. 有机酸的离子排斥色谱分析研究[J]. 色谱，1992，10（3）：133-136.
[9]丁明玉，陈培榕，罗国安. 单一阴离子交换柱同时分离有机酸和无机阴阳离子[J]. 分析化学，1997，25（2）：161-164.
[10]沈 宏，严小龙，郑少玲，等. 菜豆有机酸和无机阴离子同时分析的离子色谱法[J]. 华南农业大学学报：自然科学版，2001，22（2）：8-10.
[11]郜志峰，傅承光. 单柱离子色谱同时分析有机酸和无机阴离子的研究[J]. 分析测试学报，1994，13（5）：32-36.
[12]刘克纳，沈冬青，等. 有机酸与无机阴离子的梯度离子色普法分析研究[J]. 色谱，1997，15（4）：334-337.
[13]鲁如坤. 土壤农业化学分析方法[M]. 北京：中国农业科学技术出版社，2000：463-473.
[14]赵景婵，郭治安，常建华，等. 有机酸类化合物的反相高效液相色谱法的分离条件研究[J]. 色谱，2001，19（3）：260-263.
[15]李海生，吴贵华. HPLC法用于北山楂和云南山楂中主要有机酸和维生素C的分析比较[J]. 中草药，1990，21（4）：13-14.
[16]林维宣，房学军，杨 红. 高效液相色谱法测定山楂中有机酸的研究[J]. 大連轻工业学院学报，1992，11（3/4）：21-24.
[17]成志强，孙成均，黎源倩. 反相高效液相色谱法同时测定食品和多维片中8种水溶性维生素[J]. 分析化学，2001，29（9）：1068-1071.
[18]李连朝，李天荣，汪沛洪. 反相HPLC测定食物中的有机酸[J]. 分析测试通报，1989，8（3）：21-26.
[19]陈文华，张 旸，李 鑫. 高效液相色谱法测定果酒中的有机酸[J]. 中国卫生检验杂志，2003，13（4）：454，453.
[20]毕丽君，张 骊，张鸿发. 固相萃取高效液相色普法分析酱油中的有机酸[J]. 分析化学，2000，28（11）：1391-1394.