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灵芝(Ganoderma lucidum)是担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌,它是一种药用真菌,日常生活中出现的药用灵芝一般为灵芝干燥子实体。灵芝在我国分布较广,成分复杂,其在不同产地或不同的品种间成分含量不同,灵芝中活性成分主要为灵芝多糖和灵芝三萜类化合物,具有突出的保肝解毒、安神、抗肿瘤、调节免疫力、防治慢性支气管炎等药理活性。由灵芝制成的制剂、复方等常用于肝炎、肝纤维化、肝癌的临床研究。目前国内外关于灵芝抗乙肝病毒的研究主要集中于灵芝的临床应用研究,而对于灵芝抗乙肝病毒的系统性的体外药理实验研究较少,本实验利用转染了乙肝病毒的HepG2.2.15乙肝细胞模型,通过跟踪灵芝抗乙肝病毒的细胞学实验进行了灵芝抗乙肝病毒的活性成分筛选,研究内容主要分为以下三个方面。1.灵芝多糖的提取及其分离纯化。根据提取灵芝醇提物、水提物抗乙肝病毒的实验结果(水提物效果较好),对灵芝水提物进行浓缩、80%乙醇沉淀,得到灵芝多糖粗提物,含量为灵芝重量的2.8%。对灵芝多糖去蛋白脱色后,对灵芝粗多糖分步醇沉,依次调整乙醇浓度,分别得到灵芝20%、40%、60%、80%醇沉多糖,根据药理实验,60%醇沉多糖具有较好的抗乙肝病毒作用,故对60%分别经DEAE纤维素离子交换柱和SephadexG-100葡聚糖凝胶层析柱进行进一步分离,最后得到GLP-1和GLP-2这两种主要成分,这两种多糖通过凝胶柱层析法、琼脂糖凝胶电泳法、高效凝胶渗透色谱法进行纯度鉴定,结果显示这两种多糖均为均一多糖。2.灵芝多糖的理化性质及其结构初步探究。GLP-1为白色粉末,GLP-2淡黄色亮片状固体,它们均易溶于水,不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂。高效凝胶渗透色谱法测得GLP-1的分子量为95279Da,GLP-2的分子量为578096Da,对多糖进行水解衍生化后,利用气相色谱测其单糖组成,结果表明GLP-2含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖这6种单糖,而GLP-1中不含有鼠李糖,GLP-1各单糖的摩尔比为 1:1.3:3.0:15.0:2.6,GLP-2 中各单糖的摩尔比为:1.2:2.2:1:3.8:25.4:1.3。红外谱图表明灵芝多糖GLP-1和GLP-2均含有多糖的特征吸收峰,其中GLP-2中可能含有呋喃糖苷。刚果红实验表明GLP-1可能含有三股螺旋结构,而GLP-2中不存在。3.灵芝多糖体外抗乙肝病毒活性成分的筛选。以携带乙肝病毒的HepG2.2.15细胞为灵芝体外抗乙肝病毒的实验模型。实验分别以灵芝醇提物、水提物、20%、40%、60%、80%醇沉多糖、灵芝多糖GLP-1和GLP-2作为供试药,利用MTT法测细胞毒性,然后利用SPSS20.0计算TC50;利用ELISA法测HepG2.2.15细胞上清液中抗原HBsAg和HBeAg含量,用SPSS20.0计算IC50,最后以TC50/IC50即TI值作为各供试药的药效评价指数。结果显示,灵芝醇提物的对HBsAg和HBeAg两种抗原的TI值分别为2.04和1.07,灵芝水提物对HBsAg和HBeAg两种抗原的TI值分别为2.15和0.67,水提物的抗乙肝病毒活性效果较好;在各级醇沉多糖的抗乙肝病毒实验中,60%显示出较好的抗乙肝活性,其对HBsAg和HBeAg两种抗原的TI值分别为5.95和1.25,显示出对HBsAg抗原的显著抑制作用;在灵芝均一多糖的抗乙肝病毒实验中,GLP-1显示出良好的抗乙肝活性,其对HBsAg和HBeAg两种抗原的TI值分别为 4.79 和 2.52。