【摘要】 目的 研究胸腺切除对重症肌无力(MG)患者外周血淋巴细胞(PBL)中Fas表达及T淋巴细胞亚群的影响,探讨胸腺切除术治疗MG与Fas介导的细胞凋亡的关系。方法 采用流式细胞技术检测17例MG患者及13例健康对照组PBL中CD4、CD8及Fas表达。结果 与对照组相比,无行胸腺切除术组MG患者PBL中CD4-CD8+细胞比例升高,CD4-CD8-细胞比例下降,差异有统计学意义(P<0.05);行胸腺切除术组CD4-CD8+细胞比例较无行胸腺切除术组下降,差异有统计学意义(P<0.05)。无行胸腺切除术组MG患者PBL中Fas+、CD8+Fas+细胞比例以及行胸腺切除术组Fas+细胞比例均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。行胸腺切除术组MG患者PBL中Fas+、CD4+Fas+及CD8+Fas+细胞比例低于无行胸腺切除术组,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论 MG患者存在外周血T淋巴细胞亚群分布异常,胸腺切除可减少此异常。MG患者PBL表面Fas表达升高,可能反映体内T淋巴细胞的活化及CD8+T淋巴细胞介导的细胞毒性作用增强。胸腺切除可降低PBL中Fas的表达,可能与治疗MG的机制有关。
　　【关键词】重症肌无力;Fas抗原;T淋巴细胞亚群;胸腺切除
　　
　　The influences of thymectomy on the fas expression and T Cell subsets in peripheral blood lymphocyte from patients with myasthenia gravis
　　
　　MAI Wei-hua,KOU Li,ZHOU Wen-ying,et al. Department of Neurology,Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,ZhuHai 519000,China
　　
　　【Abstract】 Objective To investigate the influences of thymectomy on the Fas expression and T cell subsets in peripheral blood lymphocyte(PBL) from patients with myasthenia gravis(MG),so as to make sure whether Fas-mediated apoptosis is involved in the mechanism of thymectomy in MG therapy.Methods We analyzed CD4、CD8 and Fas expressions in PBL from 17 patients with MG and 13 healthy controls using flow cytometric analysis.Results The percentage of CD4-CD8+cells in PBL of MG patients without thymectomy was significant higher,while the percentage of CD4-CD8-cells was significant lower,compared with controls(P<0.05).The percentage of CD4-CD8+cells in PBL of MG patients with thymectomy was significant lower than the ones without thymectomy(P<0.05).The percentages of Fas+and CD8+Fas+cells in PBL of MG patients without thymectomy,as well as the percentage of Fas+cells in PBL of MG patients with thymectomy,were significant higher than that of controls(P<0.05).The percentages of Fas+,CD4+Fas+and CD8+Fas+cells in PBL of MG patients with thymectomy were lower than the ones without thymectomy,but the differences were not significant(P>0.05).Conclusion T cell subsets in PBL from patients with MG is abnormal,compared with healthy control.After thymectomy,this abnormality could be revised.Fas expression on PBL of patients with MG is increased,which most likely reflects lymphocyte activation in vivo,as well as increased CD8+T cell-mediated cytotoxic effect.Fas expression on PBL is decreased after thymectomy,which may be involved in the mechanism of thymectomy in MG therapy.
　　【Key words】Myasthenia gravis;Fas antigen;T cell subsets;Thymectomy
　　
　　DOI:10.3760/cma.j.issn 1673-8799.2010.06.16
　　作者單位:519000中山大学附属第五医院神经内科
　　
　　重症肌无力(myasthenia gravis.MG)是一种神经-肌肉接头传递功能障碍的获得性自身免疫性疾病,主要累及突触后膜上的乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor,AchR),由抗乙酰胆碱受体抗体(AchRAb)介导。然而,MG确切的发病机制迄今尚未清楚。胸腺与MG的发病密切相关。10%~15%的MG患者伴有胸腺瘤,50%~60%伴有胸腺增生[1]。胸腺切除术治疗MG可获得良好疗效[2]。Fas/CD95是一细胞表面分子,属于肿瘤坏死因子家族成员。Fas通过与其配体FasL结合诱导细胞凋亡。Fas/FasL对于调节自身抗原反应性T淋巴细胞的克隆清除,维持机体内免疫功能状态的稳定,防止自身免疫性疾病的发生具有重要意义。关于Fas/FasL与MG的关系目前国内外报道尚少。本实验通过流式细胞技术检测MG患者外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL)表面CD4、CD8及Fas的表达,研究胸腺切除术对MG患者PBL中Fas表达及T淋巴细胞亚群的影响,探讨胸腺切除术治疗MG与Fas/FasL介导的细胞凋亡的关系。
　　1 材料与方法
　　1.1 研究对象 MG患者组17例,为2007年10月至2009年12月我院神经内科住院及门诊患者,根据典型临床表现、新斯的明试验及部分患者神经重复电刺激检查确诊。其中男6例,女11 例,年龄22~76岁,平均(46.47±14.35)岁,病程8个月~20年,平均(6.43±5.15)年。Osserman分型:I型4例(23.5%),IIA型4例(23.5%),IIB型6例(35.3%),IV型3例(17.6%)。其中11例患者行胸腺切除术治疗,术后病理:胸腺增生7例(63.6%),胸腺瘤2例(18.2%),胸腺脂肪瘤1例(9.1%),胸腺多房囊肿1例(9.1%)。所有患者均不伴有感染性疾病及其他免疫性疾病,采血前3个月内未接受过免疫抑制剂治疗。正常对照组13例,为健康自愿献血者,男4例,女9例,平均年龄(40.23±11.05)岁。本研究得到中山大学附属第五医院伦理委员会批准,取得了受试对象的知情同意。
　　1.2 主要试剂 藻红蛋白标记小鼠抗人Fas/CD95单克隆抗体(Fas/CD95-PE)、多甲藻黃素叶绿素蛋白标记小鼠抗人CD4单克隆抗体(CD4-PerCP)、异硫氰酸荧光素标记小鼠抗人CD8单克隆抗体(CD8-FITC)、同种型荧光染色免疫球蛋白(小鼠抗人IgG1-PE、IgG1-PerCP、IgG1-FITC),均为美国Becton Dickinson公司产品,购自广州流式生物科技有限公司。
　　1.3 流式细胞术(Flow cytometry analysis) 取MG患者及对照组新鲜肝素钠抗凝血100 ul,加入3种小鼠抗人荧光素标记的单克隆抗体Fas/CD95-PE、CD4-PerCP、CD8-FITC各20 ul,混匀后室温避光孵育15~20 min。加入100 ul溶血素(BD Bioscience,USA)混匀,室温避光静置10 min,离心10 min(1000 r//min)后去上清。PBS洗涤2次后,加入1%多聚甲醛适量固定细胞,避光放置10 min,以同种型荧光染色免疫球蛋白(小鼠抗人IgG1-PE,IgG1-PerCP,IgG1-FITC)作为阴性对照,用FACScan型流式细胞仪(Becton Dickinson,USA)进行检测,使用Cell Quest软件分析PBL表面CD4、CD8及Fas抗原的表达。
　　1.4 统计学方法 使用SPSS 16.0软件。正态性检验采用one sample Kolmogorov-Smirnov test,正态分布计量资料用均数±标准差(x±s)描述,组间差异比较采用one-way ANOVA方差分析,多组均数比较采用SNK及LSD法,双侧检验水准α=0.05。P<0.0为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 MG患者与对照组PBL表面CD4、CD8分子的表达 与对照组相比,无行胸腺切除术组MG患者PBL中CD4-CD8+细胞比例升高,CD4-CD8-细胞比例下降,差异有统计学意义(P=0.028及0.047);行胸腺切除术组CD4-CD8+细胞比例较无行胸腺切除术组下降,差异有统计学意义(P=0.019)。结果见表1。
　　
　　表1
　　
　　MG患者与对照组外周血淋巴细胞表面CD4、CD8分子的表达(x±s,%)
　　
　　组别例数CD4+CD8-CD4-CD8+CD4+CD8+CD4-CD8-CD4+/CD8+
　　无行胸腺切除术MG患者630.372±6.49036.733±11.5840.392±0.19232.422±12.0930.928±0.421
　　行胸腺切除术MG患者1136.070±7.85325.248±7.6200.576±0.51238.108±7.1061.651±0.962
　　对照组1330.285±6.63526.311±8.9990.448±0.33342.957±11.5451.292±0.510
　　三组比较P值0.1200.044*0.5990.1250.137
　　F值2.3003.5090.5232.2462.143
　　两两比较P值 P10.1250.019*0.3630.2840.052
　　 P20.9800.028*0.7740.047*0.302
　　 P30.0560.7770.4330.2580.222
　　注:P1为无行胸腺切除术MG组与行胸腺切除术MG组比较P值;P2为无行胸腺切除术MG组与对照组比较P值;P3为行胸腺切除术MG组与对照组比较P值。*P<0.05
　　
　　2.2 MG患者与对照组PBL表面Fas抗原的表达 无行胸腺切除术组MG患者PBL中Fas+、CD8+Fas+细胞比例以及行胸腺切除术组Fas+细胞比例均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。行胸腺切除术组MG患者PBL中Fas+、CD4+Fas+及CD8+Fas+细胞比例低于无行胸腺切除术组,但差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表2。
　　
　　表2
　　
　　MG患者与对照组外周血淋巴细胞表面Fas抗原的表达(x±s,%)
　　
　　组别例数Fas+CD4+Fas+CD8+Fas+
　　无行胸腺切除术MG患者644.792±6.14566.163±12.45861.140±11.818
　　行胸腺切除术MG患者1139.962±8.12263.424±9.98751.776±9.840
　　对照组1331.219±12.99955.179±10.84945.590±11.497
　　三组比较P值0.026*0.0800.026*
　　F值4.1992.7724.167
　　两两比较P值 P10.3650.6230.104
　　 P20.013*0.0500.008*
　　 P30.048*0.0750.180
　　注:P1为无行胸腺切除术MG组与行胸腺切除术MG组比较P值;P2为无行胸腺切除术MG组与对照组比较P值;P3为行胸腺切除术MG组与对照组比较P值。*P<0.05
　　
　　3 讨论
　　Fas/FasL是介导细胞凋亡的主要途径之一。许多自身免疫性疾病存在自身反应性淋巴细胞清除障碍,尤其是外周,与Fas介导的细胞凋亡缺陷有关[3]。MG属于器官特异性自身免疫性疾病,胸腺与MG的发病密切相关。胸腺可能是MG患者自身免疫反应的始动及维持部位。胸腺切除术后,MG患者体内抗AchR抗体滴度下降[4]。然而,胸腺切除术治疗MG与Fas/FasL介导的细胞凋亡的关系迄今尚未明确。
　　Masunaga等[5]报道Fas抗原及Fas mRNA在MG患者胸腺细胞中表达均下降。Utsugisawa等[6]则发现Fas mRNA在MG患者胸腺细胞中的表达不下降,反而升高。Moulian等[7]报道抗AChR抗体阳性的MG患者Fas高表达的胸腺细胞比例升高。MG患者胸腺瘤中Fas的表达显著高于正常胸腺组织[8]。另有报道MG患者CD4+CD8+胸腺细胞Fas表达降低,CD4-CD8+胸腺细胞Fas表达升高[9]。上述研究提示MG患者胸腺细胞存在Fas表达异常。本实验通过研究胸腺切除术对MG患者PBL中Fas表达及T淋巴细胞亚群的影响,探讨胸腺切除术治疗MG与Fas/FasL介导的细胞凋亡的关系。
　　關于MG患者外周血T淋巴细胞亚群的研究目前结果不一,有报道MG患者外周血单个核细胞CD4+CD8-细胞比例下降[10];另有报道外周血CD8+T淋巴细胞百分率下降,CD4+/CD8+比值升高[11]。本实验结果示,无行胸腺切除术组MG患者PBL中CD4-CD8+细胞比例升高,CD4-CD8-细胞比例下降。与无行胸腺切除术组对比,行胸腺切除术组CD4-CD8+细胞比例下降,差异有统计学意义;CD4+CD8+细胞比例及CD4+/CD8+比值升高,但差异无统计学意义。本实验结果表明MG患者存在外周血T淋巴细胞亚群分布异常,胸腺切除术对外周血T淋巴细胞亚群分布具有影响。
　　国内有学者发现MG患者外周血单个核细胞中Fas+、CD4+Fas+细胞比例低于对照组,提示MG患者外周血淋巴细胞可能存在活化诱导的细胞凋亡障碍,活化的淋巴细胞不能通过Fas途径凋亡,从而引起过强的免疫应答,导致自身免疫性疾病的发生[10]。Moulian等[7]报道MG患者胸腺细胞Fas的高表达在外周未被中和,外周血淋巴细胞Fas的表达仍升高。本实验结果示,无行胸腺切除术组MG患者PBL中Fas+及CD8+Fas+细胞比例高于对照组,行胸腺切除术组MG患者PBL中Fas+细胞比例高于对照组,与Moulian的报道一致。已有研究表明系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者外周血淋巴细胞Fas的表达升高,并认为其反映了体内T淋巴细胞的活化[12,13],因为SLE患者外周血T淋巴细胞活化标记物CD25[14]、MHC-II分子[15]的表达增加,且幼稚T淋巴细胞在体外经促有丝分裂刺激后可诱导Fas产生[15]。此外,有报道FasL参与不依赖Ca2+的T细胞介导的细胞毒性作用[17],SLE患者CD8+T淋巴细胞Fas表达的增高还可能与FasL的表达相关,从而促进Fas+CD8+T淋巴细胞介导的组织损伤[12]。本实验结果示MG患者PBL中Fas+及CD8+Fas+细胞比例高于对照组,推测可能反映了MG患者体内T淋巴细胞的活化及Fas+CD8+T淋巴细胞介导的细胞毒性作用增强,与MG的发病机制有关。本实验结果还显示,行胸腺切除术组MG患者外周血Fas+、CD4+Fas+及CD8+Fas+细胞比例均低于无行胸腺切除术组,虽然差异无统计学意义,仍提示胸腺切除可能通过降低PBL中Fas的表达,减少体内T淋巴细胞的活化及Fas+CD8+T淋巴细胞介导的细胞毒性作用,达到治疗MG的目的。加大样本量深入研究有助于进一步明确胸腺切除术治疗MG与Fas/FasL介导的细胞凋亡的关系。
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