论文部分内容阅读
摘要：为了提高纤维素原料对乳酸的转化率，本试验将富含纤维二糖酶的黑曲霉孢子和K25乳酸链球菌细胞共固定在海藻酸钙凝胶珠中，通过单因素试验分别测定黑曲霉和K25乳酸链球菌的配比、温度以及共固定化细胞与纤维素水解液反应体积比对共固定化细胞发酵产乳酸的影响，可以得出：两种菌的配比为1：2时，共固定化产乳酸的转化率最高，可达到84.4%左右；当温度为48℃时，乳酸转化率最高为83.2%；当共固定化细胞体积为1：60时，乳酸达到最大浓度42.45g/L。然后利用响应曲面法优化发酵产乳酸的工艺条件，建立了菌种配比（X1），温度（X2），共固定化细胞与纤维素水解液反应体积比（X3）之间的数学模型：Y=45.38-1.17X1-137X2-1.57X3+1.06 X1X2-1.99X1X3-3.20 X2X3- 2.99X12-3.34 X22-7.06X32。最佳挤压工艺条件为：菌种配比1：2、温度48.51℃、共固定化细胞与纤维素水解液反应体积比22%，在此条件下，乳酸浓度可达到45.75%。
关键词：共固定化；产酸；试验条件优化
中图分类号：TS252.54 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2013）-04-0092-3
0 引言
乳酸及乳酸的聚合物既可作为一种转化成为能源的物质，同时也可以合成一些我们生活所必需的原材料物质，所以说乳酸是一种有着广泛的应用价值和市场发展前景的物质。[1]随着我国每年人口的递增和退耕还林实施，粮食的来源少了，但消耗却很多，利用粮食类资源生产乳酸的传统工艺面临着原材料紧缺的严峻危机。[2]共固定化细胞发酵纤维素水解液产乳酸作为一种具有重要现实意义的技术也有一定的缺点，就是纤维素对乳酸的转化率和产率都很低，所以为了提高乳酸转化率对影响试验结果的因素进行了优化。[3]
1 试验材料
1.1 试剂
1.2 仪器与设备
2 共固定化细胞发酵产酸试验方法
2.1 菌种及保存
黑曲霉菌株，為本实验室购买的纤维二糖酶高产菌种。乳酸链球菌（Lactobacillus. plantarum k25）为本实验室保藏菌种，贮存于20%脱脂牛奶试管中。
2.2 酶制剂和纤维素水解液的制备及乳酸的测定方法
2.2.1 纤维素水解液的制备[4] 将产自吉林长春的玉米秸秆风干、粉碎后过20目筛子得到直径大约在3～5mm左右的颗粒，取0.5kg粉末加入到4L质量分数为1%的H2SO4溶液于在110℃下处理三个小时左右，用蒸馏水反复洗滤渣至pH值为5.0。在50℃下用购买的里氏木霉纤维素酶处理清洗完的纤维素残渣48个小时，在这个过程中使pH恒定在4.8。该纤维素水解液储存在4℃冰箱中用作共固定化细胞发酵产乳酸生长所需的碳源。
2.2.2 酶制剂制备 纤维素酶由本实验室自制的，利用里氏木霉（液体发酵而成，每克酶粉含700个滤纸酶活力国际单位，36个纤维二糖酶活力国际单位）。纤维二糖酶由黑曲霉固态发酵制得。[5]
2.2.3 乳酸含量测定方法 采用EDTA定钙法测定。[6]
2.3 共固定化细胞体系的构建方法
将保存在甘油管里的黑曲酶菌株活化后经过固态发酵培养到可以得到大量孢子为止。用蒸馏水把黑曲霉孢子稀释成含有高浓度纤维二糖酶的悬浮液，然后把处在生长对数期的乳酸链球菌稀释制成悬浮液，把两种悬浮液按照一定比例混合后，将混合后的液体在无菌的状态下倒入海藻酸钠溶液中，在这个过程中始终保持海藻酸钠的质量浓度为30g/L。用涡旋混合器振荡使其均匀，并用注射器缓慢注入到质量浓度为10g/L的CaCl2溶液中，形成均匀的直径大约为2.5～3.0mm的共固定化凝胶珠，凝胶珠达到CaCl2溶液体积的2/3时停止，将凝胶珠放置在4℃冰箱中固化10h后保存备用。[7]
2.4 黑曲霉孢子和乳酸杆菌配比确定的方法
在共固定化细胞体系内的黑曲霉孢子中含有大量纤维二糖酶，可把纤维素水解液中的纤维二糖转化成葡萄糖，这样有助于乳酸链球菌的下一步发酵；并且随着乳酸链球菌很快的将葡萄糖发酵成乳酸，这样又消除了葡萄糖的积累对纤维二糖酶酶活性的反馈抑制作用，也有效地促进了纤维二糖酶的生物催化反应，可以得出两者之间存在着十分明显的协同作用。但是，这样的协同作用仅仅是当共固定化细胞体系中的乳酸链球菌子与黑曲霉孢子菌数量有一个非常合理配比时，才可以得到更好的发挥。把乳酸链球菌细胞悬浮液与黑曲霉孢子悬浮液按照几种不同的体积配比混合，分别用海藻酸钠制成共固定化细胞凝胶珠，再通过采用共固定化细胞在底物为纤维素水解液中发酵产乳酸。[8]
2.5 温度对共固定化细胞发酵纤维素酶水解液产乳酸的影响方法
据了解，纤维二糖酶水解纤维二糖产葡萄糖的最适温度为50℃，而乳酸链球菌发酵葡萄糖产乳酸的最适温度为48℃，两个最适温度有所差异，所以要通过实验得出共固定化细胞反应的适宜温度。[9]
2.6 共固定化细胞与纤维素水解液最适反应体积比的确定方法
因为实验室使用的柱式反应器就是250mL的，所以控制固定化细胞和纤维素酶水解液总体积为200mL，分别加入体积为20mL、40mL、60mL、80mL、100mL共固定化细胞，使柱式反应器中共固定化细胞和纤维素水解液体积比不同，在最适反应条件下发酵产乳酸48h。[10]
2.7 试验条件优化方法
采用响应曲面的方法对发酵产乳酸试验条件进行优化。[11]响应曲面图形是指在其他因素不变的条件下，响应面与试验中其他因素所构成的三维曲面图，可以直观地反映个因素之间的相互作用对响应值的影响。根据Box-Behnken的中心组合设计原理[13]，以三个主要因素，即菌种配比、发酵温度、细胞与纤维素水解液体积比，以乳酸浓度为考察指标[14]，因素水平表如表3所示。 3 结果分析
3.1 黑曲霉孢子和乳酸链球菌配比的确定
在共固定化细胞体系内的黑曲霉孢子中含有大量纤维二糖酶，可把纤维素水解液中的纤维二糖转化成葡萄糖，这样有助于乳酸链球菌的下一步发酵；并且随着乳酸链球菌很快的将葡萄糖发酵成乳酸，这样又消除了葡萄糖的积累对纤维二糖酶酶活性的反馈抑制作用，也有效地促进了纤维二糖酶的生物催化反应，可以得出两者之间存在着十分明显的协同作用。从表（Y为乳酸转化率，P为乳酸产率）可以得出：孢子悬浮液与乳酸链球菌悬浮液的配比为1∶1时最为适宜，纤维二糖酶活力为2.6 CBIU。[15]
3.2 温度对产乳酸的影响结果
从表5我们可以看出：共固定化细胞反应在不同的温度条件下发酵纤维素酶水解液产乳酸的量也是不同的。当共固定化细胞反应体系温度为48℃时，纤维二糖酶和乳酸链球菌的协同作用都能够发挥出非常好的作用。[16]
3.3 共固定化细胞和纤维素水解液最适体积比的确定
从图1可以看出，当共固定化细胞体积比例较小的时侯，不能够很好的把纤维素水解液产生的所有的糖发酵产乳酸，因而转化得到的乳酸浓度很低，柱式反应器中乳酸的总质量也非常的小。而随着共固定化细胞在总反应体积中的比例的增大，乳酸浓度也逐渐的升高，当共固定化细胞体积为60mL时，乳酸达到最大浓度42.45g/L，反应器中的乳酸总质量达到5.34g。[17]此后，乳酸浓度不随着共固定化细胞体积的增大而发生变化，但由于柱式反应器中的可利用反应空间减小，生成的乳酸总质量逐渐下降。通过这个实验我们可以得到，在本实验条件下，共固定化细胞体积为60mL时最适宜。
3.4 共固定化细胞发酵纤维素水解液产乳酸试验条件的响应面优化结果
试验设计与结果如表6所示，结果表明，对乳酸所建立的二次项模型具有显著性（P=0.0303<0.05），失拟项P=0.1989>0.05，不显著；模型的调整确定系数R2=0.8534，说明该模型能解释85.34%响应值的变化；并且从图2可知，因而模型的拟合程度比较好，试验误差小，残差点几乎分别在同一条直线上，因此可以利用此模型预测和分析发酵产乳酸浓度。
以上三个图为它们两两之间的交互作用图和等高线图，可以看出菌种配比的影响效果最大，其次是温度，最后是共固定化细胞和纤维素水解液体积比。然后对响应面优化出来的试验条件进行验证试验，通过公式算出的乳酸浓度为45.75%，实际测出为45.15%，达到拟合度。
4 结论
（1）利用响应曲面法优化发酵产乳酸的工艺条件，建立了菌种配比（X1），温度（X2），共固定化细胞与纤维素水解液反应体积比（X3）之间的数学模型：Y=45.38-1.17X1-137X2-1.57X3+1.06 X1X2-1.99X1X3-3.20 X2X3- 2.99X12-3.34 X22-7.06X32。最佳挤压工艺条件为：菌种配比1：2、温度48.51℃、共固定化细胞与纤维素水解液反应体积比22%，在此条件下，乳酸浓度可达到为45.75%。
（2）将富含纤维二糖酶的黑曲霉孢子和K25乳酸链球菌细胞一起包埋固定，将共固定化细胞体系与纤维素原料的酶水解相耦联，构建成新型串联式生物反应器。通过试验条件优化可以进一步提高乳酸转化率9.8%。
参考文献
[1] 陈卓贤，沈春明，陈国良.味精生产工艺学.北京：中国轻工业出版社，1992，82.
[2] 张力田.碳水化合物.北京：中国轻工业出版社，1988：347-377.
[3] 姚允斌，解涛，高英敏等.物理化学手则.上海：上海科学技术出版社，1985：102.
[4] 陈卓贤，沈春明，陈国良.味精生产工艺学.北京：中国轻工业出版社，1992：82.
[5] 上久保正等.纤维素酶的水解.应用微生物，1984，（4）：31-35.
[6] 罗堵，夏黎明，林建平等.纤维素酶水解及同时糖化和乳酸发酵过程动力学.化工学报，1998，49（2）：162-168.
[7] 徐坚平，刘军松，孔维等.利用秸秆类物质进行微生物共发酵生产单细胞蛋白.微生物学通报，1995，22（4）：222-225.
[8] 万海清，何泽超，杨晓艳等.霉菌利用纤维素生产scP的研究.饲料研究，1999，（6）：10-13.
[9] 陈育如，夏黎明，吴棉斌，岑沛霖.植物纤维素原料预处理基础的研究进展.化工进展，1999，（4）：24-26.
[10] 欧阳平凯，韩祖国.木质纤维素物质水解新技术及应用.化工进展，1992，（l）：42-45.
[11] 万海清，何泽超，杨晓艳等.霉菌利用纤维素生产scP的研究.饲料研究，1999，（6）：10-13.
[12] 余世袁.林产资源的生物转化与利用.南京林业大学学报，2000，24（2）：5.
[13] 张树政.酶制剂工业（下册）.北京：科学出版社，1998，595-624.
[14] 戚以政，汪叔雄.生化反应动力学与反应器（第二版）.北京：北学工业出版社，1999：27-40.
[15] 将明住，吴芷萍，许孟琴.L-乳酸发酵的研究.微生物学报，1991，31：41-47.
[16] 杨虹，林宇野，史美榕.L-乳酸生产菌的选育.福州大学学报（自然科学版），1994，22（2）：103-106.
[17] 陈育如，夏黎明，滓沛林.纤维素酶和米根霉同时糖化发酵纤维素为L-乳酸.食品与发酵工业，2000，26（3）：6-9.
作者简介：郑庆超（1986-），男，吉林农业大学食品科学与工程学院硕士研究生，研究方向：微生物技术。
通讯作者：迟燕平（1977-），女，吉林省农业科学院农产品加工所副研究员，博士，研究方向：農副产品综合利用。
关键词：共固定化；产酸；试验条件优化
中图分类号：TS252.54 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2013）-04-0092-3
0 引言
乳酸及乳酸的聚合物既可作为一种转化成为能源的物质，同时也可以合成一些我们生活所必需的原材料物质，所以说乳酸是一种有着广泛的应用价值和市场发展前景的物质。[1]随着我国每年人口的递增和退耕还林实施，粮食的来源少了，但消耗却很多，利用粮食类资源生产乳酸的传统工艺面临着原材料紧缺的严峻危机。[2]共固定化细胞发酵纤维素水解液产乳酸作为一种具有重要现实意义的技术也有一定的缺点，就是纤维素对乳酸的转化率和产率都很低，所以为了提高乳酸转化率对影响试验结果的因素进行了优化。[3]
1 试验材料
1.1 试剂
1.2 仪器与设备
2 共固定化细胞发酵产酸试验方法
2.1 菌种及保存
黑曲霉菌株，為本实验室购买的纤维二糖酶高产菌种。乳酸链球菌（Lactobacillus. plantarum k25）为本实验室保藏菌种，贮存于20%脱脂牛奶试管中。
2.2 酶制剂和纤维素水解液的制备及乳酸的测定方法
2.2.1 纤维素水解液的制备[4] 将产自吉林长春的玉米秸秆风干、粉碎后过20目筛子得到直径大约在3～5mm左右的颗粒，取0.5kg粉末加入到4L质量分数为1%的H2SO4溶液于在110℃下处理三个小时左右，用蒸馏水反复洗滤渣至pH值为5.0。在50℃下用购买的里氏木霉纤维素酶处理清洗完的纤维素残渣48个小时，在这个过程中使pH恒定在4.8。该纤维素水解液储存在4℃冰箱中用作共固定化细胞发酵产乳酸生长所需的碳源。
2.2.2 酶制剂制备 纤维素酶由本实验室自制的，利用里氏木霉（液体发酵而成，每克酶粉含700个滤纸酶活力国际单位，36个纤维二糖酶活力国际单位）。纤维二糖酶由黑曲霉固态发酵制得。[5]
2.2.3 乳酸含量测定方法 采用EDTA定钙法测定。[6]
2.3 共固定化细胞体系的构建方法
将保存在甘油管里的黑曲酶菌株活化后经过固态发酵培养到可以得到大量孢子为止。用蒸馏水把黑曲霉孢子稀释成含有高浓度纤维二糖酶的悬浮液，然后把处在生长对数期的乳酸链球菌稀释制成悬浮液，把两种悬浮液按照一定比例混合后，将混合后的液体在无菌的状态下倒入海藻酸钠溶液中，在这个过程中始终保持海藻酸钠的质量浓度为30g/L。用涡旋混合器振荡使其均匀，并用注射器缓慢注入到质量浓度为10g/L的CaCl2溶液中，形成均匀的直径大约为2.5～3.0mm的共固定化凝胶珠，凝胶珠达到CaCl2溶液体积的2/3时停止，将凝胶珠放置在4℃冰箱中固化10h后保存备用。[7]
2.4 黑曲霉孢子和乳酸杆菌配比确定的方法
在共固定化细胞体系内的黑曲霉孢子中含有大量纤维二糖酶，可把纤维素水解液中的纤维二糖转化成葡萄糖，这样有助于乳酸链球菌的下一步发酵；并且随着乳酸链球菌很快的将葡萄糖发酵成乳酸，这样又消除了葡萄糖的积累对纤维二糖酶酶活性的反馈抑制作用，也有效地促进了纤维二糖酶的生物催化反应，可以得出两者之间存在着十分明显的协同作用。但是，这样的协同作用仅仅是当共固定化细胞体系中的乳酸链球菌子与黑曲霉孢子菌数量有一个非常合理配比时，才可以得到更好的发挥。把乳酸链球菌细胞悬浮液与黑曲霉孢子悬浮液按照几种不同的体积配比混合，分别用海藻酸钠制成共固定化细胞凝胶珠，再通过采用共固定化细胞在底物为纤维素水解液中发酵产乳酸。[8]
2.5 温度对共固定化细胞发酵纤维素酶水解液产乳酸的影响方法
据了解，纤维二糖酶水解纤维二糖产葡萄糖的最适温度为50℃，而乳酸链球菌发酵葡萄糖产乳酸的最适温度为48℃，两个最适温度有所差异，所以要通过实验得出共固定化细胞反应的适宜温度。[9]
2.6 共固定化细胞与纤维素水解液最适反应体积比的确定方法
因为实验室使用的柱式反应器就是250mL的，所以控制固定化细胞和纤维素酶水解液总体积为200mL，分别加入体积为20mL、40mL、60mL、80mL、100mL共固定化细胞，使柱式反应器中共固定化细胞和纤维素水解液体积比不同，在最适反应条件下发酵产乳酸48h。[10]
2.7 试验条件优化方法
采用响应曲面的方法对发酵产乳酸试验条件进行优化。[11]响应曲面图形是指在其他因素不变的条件下，响应面与试验中其他因素所构成的三维曲面图，可以直观地反映个因素之间的相互作用对响应值的影响。根据Box-Behnken的中心组合设计原理[13]，以三个主要因素，即菌种配比、发酵温度、细胞与纤维素水解液体积比，以乳酸浓度为考察指标[14]，因素水平表如表3所示。 3 结果分析
3.1 黑曲霉孢子和乳酸链球菌配比的确定
在共固定化细胞体系内的黑曲霉孢子中含有大量纤维二糖酶，可把纤维素水解液中的纤维二糖转化成葡萄糖，这样有助于乳酸链球菌的下一步发酵；并且随着乳酸链球菌很快的将葡萄糖发酵成乳酸，这样又消除了葡萄糖的积累对纤维二糖酶酶活性的反馈抑制作用，也有效地促进了纤维二糖酶的生物催化反应，可以得出两者之间存在着十分明显的协同作用。从表（Y为乳酸转化率，P为乳酸产率）可以得出：孢子悬浮液与乳酸链球菌悬浮液的配比为1∶1时最为适宜，纤维二糖酶活力为2.6 CBIU。[15]
3.2 温度对产乳酸的影响结果
从表5我们可以看出：共固定化细胞反应在不同的温度条件下发酵纤维素酶水解液产乳酸的量也是不同的。当共固定化细胞反应体系温度为48℃时，纤维二糖酶和乳酸链球菌的协同作用都能够发挥出非常好的作用。[16]
3.3 共固定化细胞和纤维素水解液最适体积比的确定
从图1可以看出，当共固定化细胞体积比例较小的时侯，不能够很好的把纤维素水解液产生的所有的糖发酵产乳酸，因而转化得到的乳酸浓度很低，柱式反应器中乳酸的总质量也非常的小。而随着共固定化细胞在总反应体积中的比例的增大，乳酸浓度也逐渐的升高，当共固定化细胞体积为60mL时，乳酸达到最大浓度42.45g/L，反应器中的乳酸总质量达到5.34g。[17]此后，乳酸浓度不随着共固定化细胞体积的增大而发生变化，但由于柱式反应器中的可利用反应空间减小，生成的乳酸总质量逐渐下降。通过这个实验我们可以得到，在本实验条件下，共固定化细胞体积为60mL时最适宜。
3.4 共固定化细胞发酵纤维素水解液产乳酸试验条件的响应面优化结果
试验设计与结果如表6所示，结果表明，对乳酸所建立的二次项模型具有显著性（P=0.0303<0.05），失拟项P=0.1989>0.05，不显著；模型的调整确定系数R2=0.8534，说明该模型能解释85.34%响应值的变化；并且从图2可知，因而模型的拟合程度比较好，试验误差小，残差点几乎分别在同一条直线上，因此可以利用此模型预测和分析发酵产乳酸浓度。
以上三个图为它们两两之间的交互作用图和等高线图，可以看出菌种配比的影响效果最大，其次是温度，最后是共固定化细胞和纤维素水解液体积比。然后对响应面优化出来的试验条件进行验证试验，通过公式算出的乳酸浓度为45.75%，实际测出为45.15%，达到拟合度。
4 结论
（1）利用响应曲面法优化发酵产乳酸的工艺条件，建立了菌种配比（X1），温度（X2），共固定化细胞与纤维素水解液反应体积比（X3）之间的数学模型：Y=45.38-1.17X1-137X2-1.57X3+1.06 X1X2-1.99X1X3-3.20 X2X3- 2.99X12-3.34 X22-7.06X32。最佳挤压工艺条件为：菌种配比1：2、温度48.51℃、共固定化细胞与纤维素水解液反应体积比22%，在此条件下，乳酸浓度可达到为45.75%。
（2）将富含纤维二糖酶的黑曲霉孢子和K25乳酸链球菌细胞一起包埋固定，将共固定化细胞体系与纤维素原料的酶水解相耦联，构建成新型串联式生物反应器。通过试验条件优化可以进一步提高乳酸转化率9.8%。
参考文献
[1] 陈卓贤，沈春明，陈国良.味精生产工艺学.北京：中国轻工业出版社，1992，82.
[2] 张力田.碳水化合物.北京：中国轻工业出版社，1988：347-377.
[3] 姚允斌，解涛，高英敏等.物理化学手则.上海：上海科学技术出版社，1985：102.
[4] 陈卓贤，沈春明，陈国良.味精生产工艺学.北京：中国轻工业出版社，1992：82.
[5] 上久保正等.纤维素酶的水解.应用微生物，1984，（4）：31-35.
[6] 罗堵，夏黎明，林建平等.纤维素酶水解及同时糖化和乳酸发酵过程动力学.化工学报，1998，49（2）：162-168.
[7] 徐坚平，刘军松，孔维等.利用秸秆类物质进行微生物共发酵生产单细胞蛋白.微生物学通报，1995，22（4）：222-225.
[8] 万海清，何泽超，杨晓艳等.霉菌利用纤维素生产scP的研究.饲料研究，1999，（6）：10-13.
[9] 陈育如，夏黎明，吴棉斌，岑沛霖.植物纤维素原料预处理基础的研究进展.化工进展，1999，（4）：24-26.
[10] 欧阳平凯，韩祖国.木质纤维素物质水解新技术及应用.化工进展，1992，（l）：42-45.
[11] 万海清，何泽超，杨晓艳等.霉菌利用纤维素生产scP的研究.饲料研究，1999，（6）：10-13.
[12] 余世袁.林产资源的生物转化与利用.南京林业大学学报，2000，24（2）：5.
[13] 张树政.酶制剂工业（下册）.北京：科学出版社，1998，595-624.
[14] 戚以政，汪叔雄.生化反应动力学与反应器（第二版）.北京：北学工业出版社，1999：27-40.
[15] 将明住，吴芷萍，许孟琴.L-乳酸发酵的研究.微生物学报，1991，31：41-47.
[16] 杨虹，林宇野，史美榕.L-乳酸生产菌的选育.福州大学学报（自然科学版），1994，22（2）：103-106.
[17] 陈育如，夏黎明，滓沛林.纤维素酶和米根霉同时糖化发酵纤维素为L-乳酸.食品与发酵工业，2000，26（3）：6-9.
作者简介：郑庆超（1986-），男，吉林农业大学食品科学与工程学院硕士研究生，研究方向：微生物技术。
通讯作者：迟燕平（1977-），女，吉林省农业科学院农产品加工所副研究员，博士，研究方向：農副产品综合利用。