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摘要：目的：探讨假性血小板减少的相关因素，为提高测定结果的准确度提供参考。方法：抽取同一患者当天静脉血，分别采用乙二胺四乙酸二钾（Ethylenediaminetetraacetic Acid-K2，EDTA-K2）抗凝，枸橼酸钠抗凝，EDTA-K2抗凝后转为枸橼酸钠抗凝处理的血液样本，三种方法处理后的血样均采用三分类和五分类法进行血小板测定，此外三种处理方法的血样均推血涂片，染色后置光学显微镜下观察血小板聚集情况。查阅相关文献结合此次实验结果分析引起测定结果差异的可能原因。结果：由于EDTA-K2导致血小板的聚集，使得依赖性假性血小板减少；经枸橼酸钠抗凝处理后，未见血小板聚集及假性血小板减少现象；自动化血细胞分析仪误将聚集的血小板判读为白细胞而使得白细胞假性增加。结论：EDTA-K2抗凝可能会引起血小板聚集与血小板假性减少，对于此类情况应采取手工计数和涂片复检法进行复测，以保证结果的准确性及避免误诊。
关键词：EDTA 枸橼酸钠抗凝 假性血小板减少 血小板聚集
Doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2013.07.223
【中图分类号】R4 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2013）07-0202-02
血小板在人体内具有维护血管内皮完整性和粘附、聚集、释放、促凝及血块收缩等重要功能，对血小板进行检测已成为入院后的常规检查项目，对于诊断多种疾病有重要作用。目前各大医院常用全自动血细胞分析仪对血小板进行测定，依据电阻抗或光散射原理推断血细胞的大小与数量，但有时血小板会以聚集状态存在，仪器误读为其它血细胞，最终出现血小板计数减少的假象，即假性血小板减少，故分析血小板假性减少的原因及应对策略就显得非常重要。本文就工作中出现的1例血小板假性减少现象进行报道并对相关的影响因素进行分析。
1 资料与方法
1.1 一般资料。2013年1月15日来我院内科就诊的73岁女性患者，在体检中心抽取该患者的静脉血，进行血细胞分析。
1.2 仪器与试剂。
三分类全自动血细胞分析仪Sysmex kx-21N
五分类全自动血细胞分析仪Sysmex XS-800i
Sysmex配套试剂
质控品：Sysmex三分类质控批号 30120822 有效期2013.4.20
Sysmex五分类质控批号 0490805 有效期2013.5.12
光学显微镜 OLYMPUS CX21
血细胞染液 瑞氏姬母萨然液 珠海贝索生物技术有限公司有效期 2014.8
EDTA-K2和枸椽酸钠抗凝试管
1.3 检验方法。静脉抽取2mL全血，以EDTA-K2抗凝，震荡混匀后置全自动血细胞分析仪（三分类）进行分析，全部操作严格按照规程要求。结果发现血小板明显低于参考区值，但该患者并无血小板减少的相关症状，因此我们对测定结果存有疑虑，于当天再次采集患者的静脉血进行测定。
抽取得到的静脉血平分为六份，共进行六次测定，分别如下：
一是EDTA-K2抗凝，采用全自动血细胞分析仪（三分类）进行分析（与首次测定方法相同）；二是EDTA-K2抗凝，采用全自动血细胞分析仪（五分类）测定；三是枸橼酸钠抗凝，采用全自动血细胞分析仪（三分类）测定；四是枸橼酸钠抗凝，采用全自动血细胞分析仪（五分类）测定；五是EDTA-K2抗凝后转后枸橼酸钠抗凝管中，采用全自动血细胞分析仪（三分类）测定；六是EDTA-K2抗凝后转后枸橼酸钠抗凝管中，采用全自动血细胞分析仪（五分类）测定。
以上全部操作均严格按照规程要求进行。行以上测定的目的在于比较实验操作、抗凝剂以及分析仪器对测定结果的影响。将第一、三和五次抗凝后的静脉血推血液涂片，用贝索瑞氏血细胞染色液染色，用光学显微镜在油镜下观察血涂片并照相，最后比较测定与观察结果并分析引起差异的原因。
2 结果
首次静脉血EDTA-K2抗凝测定结果为11×10-9/L，远低于参考值100-300×109/L，其余六次的测定结果见表1：
表1 不同的抗凝剂与测定仪器测定的血小板计数结果。
表中EDTA-K2+枸橼酸钠为EDTA-K2抗凝后再采用枸橼酸钠抗凝处理。由表可知，单纯使用EDTA-K2抗凝的血液样本无论是采用三分类还是五分类方法均出现了血小板的假性减少现象；而采用枸橼酸钠和EDTA-K2抗凝后再行枸缘酸钠抗凝的血样则测定结果正常。此外，五分类法测定的所有结果均小于三分类法，这可能是由于仪器的不同或测定误差所致，由于样本量较小，还不能得出确定的结论；EDTA-K2抗凝后转为枸橼酸钠抗凝较单用EDTA-K2抗凝的测定结果偏低，可能是由于枸橼酸钠未将所有由EDTA-K2导致的聚集血小板全部解聚，也可能是由于测定误差所致，受样本量所限，未能得出确定的结论。
血涂片结果如图1：
图中蓝色小点为血小板，从A图中明显可以看到大部分血小板出现了聚集现象，B图未见血小板的聚集，C图血小板大部分散在，但仍有部分聚集。这说明该患者静脉血采用EDTA-K2抗凝后出现了明显的聚集现象，而枸橼酸钠抗凝后未聚集，EDTA-K2抗凝后转后枸橼酸钠抗凝后大部分血小板散在，但仍有部分聚集，这也是导致EDTA-K2抗凝后转后枸橼酸钠抗凝的血小板测定结果偏低的原因。 此外，我们还发现白细胞与血小板间存在着良好的相关性，将不同测定结果的血小板与白细胞作散点图并作趋势线，求算相关系数R，结果如图2。
由图可见，当测定的血小板减少时，白细胞测量结果增大，两者呈明显的负相关（R=0.74），这说明血小板聚集的直径接近白细胞直径，全自动血细胞计数仪误判为白细胞，进而造成患者血小板假性减少和白细胞假性增高，这会给临床诊断造成严重干扰。
3 讨论
自Onder等[1]报道1例EDTA依赖性的血小板减少症（Dependent Pseudothrombocytopenia，PTCP）后，引起了国内外广泛关注。EDTA-PTCP是由于抗凝血在全自动血细胞计数仪上检测时，EDTA盐诱导血小板相互聚集、堆积，发生卫星现象，从而影响血小板计数使结果偏低。目前对EDTA-PTCP的发生机理尚不清楚，可能的原因如下[2-4]：①EDTA-PTCP的发生与血小板表面存在某种隐匿性抗原有关，有研究表明，EDTA可诱导血小板表面糖蛋白GPIIb/IIIa的表达，改变了血小板的形态及其膜表面的某种隐匿性抗原的构象，从而激活细胞膜上的磷酸脂酶A2和磷酸酶C，使血小板膜磷酸水解并释放花生四烯酸、ADP、胶原、凝血酶原、内源性钙离子等等活性物质，这些活性物质又进一步活化血小板纤维蛋白受体，使血小板与纤维蛋白原聚集成团。②与血小板卫星现象有关，血小板卫星现象是由于血小板粘附在细胞周围而得名，是存在于EDTA抗凝血中的一种体外现象。③与一些疾病密切相关，是一些疾病的伴随现象，此现象出现于一些疾病的开始或治疗过程中，随着疾病的好转而消失，多发生于自身免疫性疾病、肺心病、晚期妊娠、肝病、毒血症、癌症等。与本研究病例基本吻合，进一步佐证了其与疾病的相关怀。
采血不当造成假性血小板减少的现象较为常见[5]，一是抽血技术不熟练，难以做到一针到位，造成抽血时间延长，多次的穿刺组织损伤，组织凝血因子混入血液样品中产生小肉眼难辨的小凝块；二是抽血后的处理不当，如混合不均匀会产生局部凝血，也会使血小板测定结果偏低；三是儿童和老年患者血管不充盈且细小，抽血困难，抽血过程稍有不顺便可引起血不板聚集；四是采血样过大，当抗剂被饱和以后就会出现血小板聚集凝血，影响最终的计数结果。对于因采血不当造成的假性血小板减少，检验科应进行相关的宣传教育，让护士了解相关的注意事项并掌握标准的操作规程，以确保采集到合格的检测样品。
疾病因素也是造成血小板假性减少的一个重要因素，无论是电阻抗原理还是光散射原理的全自动血细胞计数仪，其检测血小板均具有一定的阈值，正常的血小板均在些阈值范围内，但当患者的血小板大于上限或小于下限时，仪器会误认为其它细胞或噪音而不计入血小板计数中，从而使血小板计数结果偏低。如巨大血小板综合症、特发性血小板减少性紫癜时血小板体积增大[6]；再生障碍性贫血、脾功能亢进、白血病、败血症等患者常见血小板减少[7]。对于此类患者应手工计数血小板以免误诊。
EDTA-K2是目前公认的血细胞计数抗凝剂，在临床血常数检测中得到了广泛的应用，EDTA-PTCP也并不普遍，其发病率仅为0.09%-0.21%[8，9]，但一旦发生，足以造成对这些患者的误诊误治，给患者及临床治疗工作带来很大困扰。在实际工作中，对临床上无任何出血症状而血小板减少的患者，应及时与医师沟通，加强人工血片的复检，并手工法计数血小板和白细胞以排除EDTA-PTCP。另外，经EDTA抗凝处理的血液样本再经枸橼酸钠抗凝处理后，血小板出现解聚现象，这可能是由于枸橼酸钠能够拮抗EDTA对血小板聚集相关抗原或糖蛋白的作用，最终使血小板解聚，相关的作用机理尚需要进一步的研究证实。
参考文献
[1] Onder O， Weinstcin A， Loyer LW. Pseudothrombocytopenia caused by platelet agglutinins that are reactive in blood anticoagulated with chelating ageats[J]. Blood， 1980， 56： 177-182
[2] 郑军.EDTA依赖性假性血小板减少症血小板表面糖蛋白活化的研究[J].中国血液流变学杂志，2007，17（3）：481-482
[3] 张昌峰，朱俊.浅析EDTA依赖性假性血小板减少症病因[J].安徽医药，2009，3（3）：302
[4] Hornef M W， Hackstein H， Kirchner H， et al. Significance of cytoplasmic staining in the cytomegalovirus pp65 antigen test [J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis， 1999， 18 （1）： 66-68
[5] Tietz M. Immune responsiveness in orthopedic surgery patients after transfusion of autologous or allergenic blood[ J]. Transfusion， 1995， 35（5）： 378-383
[6] Bizzaro N. EDTA-dependent pseudothrombocytopenia： a clinical and epidemiological study of 11 cases with 10-year follow up [J]. Am J Hematol， 1995， 50（2）： 103-109
[7] 王振义，李家增，阮长耿.血栓与止血基础理论与临床[M].上海：上海科技出版社，1996：227-237
[8] Kurata Y， Havashi S， Iouzaki K， et al. Four cases of pseudothrombocytopenia due to platelet cold agglutinins[J]. Rinsho Ketsueki， 2006， 47（8）： 781-786
[9] 邝妙欢，陆霄云，钟义富，等.假性血小板减少的相关因素[J].中山大学学报（医学科学版），2009，30（8）：121-124
关键词：EDTA 枸橼酸钠抗凝 假性血小板减少 血小板聚集
Doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2013.07.223
【中图分类号】R4 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2013）07-0202-02
血小板在人体内具有维护血管内皮完整性和粘附、聚集、释放、促凝及血块收缩等重要功能，对血小板进行检测已成为入院后的常规检查项目，对于诊断多种疾病有重要作用。目前各大医院常用全自动血细胞分析仪对血小板进行测定，依据电阻抗或光散射原理推断血细胞的大小与数量，但有时血小板会以聚集状态存在，仪器误读为其它血细胞，最终出现血小板计数减少的假象，即假性血小板减少，故分析血小板假性减少的原因及应对策略就显得非常重要。本文就工作中出现的1例血小板假性减少现象进行报道并对相关的影响因素进行分析。
1 资料与方法
1.1 一般资料。2013年1月15日来我院内科就诊的73岁女性患者，在体检中心抽取该患者的静脉血，进行血细胞分析。
1.2 仪器与试剂。
三分类全自动血细胞分析仪Sysmex kx-21N
五分类全自动血细胞分析仪Sysmex XS-800i
Sysmex配套试剂
质控品：Sysmex三分类质控批号 30120822 有效期2013.4.20
Sysmex五分类质控批号 0490805 有效期2013.5.12
光学显微镜 OLYMPUS CX21
血细胞染液 瑞氏姬母萨然液 珠海贝索生物技术有限公司有效期 2014.8
EDTA-K2和枸椽酸钠抗凝试管
1.3 检验方法。静脉抽取2mL全血，以EDTA-K2抗凝，震荡混匀后置全自动血细胞分析仪（三分类）进行分析，全部操作严格按照规程要求。结果发现血小板明显低于参考区值，但该患者并无血小板减少的相关症状，因此我们对测定结果存有疑虑，于当天再次采集患者的静脉血进行测定。
抽取得到的静脉血平分为六份，共进行六次测定，分别如下：
一是EDTA-K2抗凝，采用全自动血细胞分析仪（三分类）进行分析（与首次测定方法相同）；二是EDTA-K2抗凝，采用全自动血细胞分析仪（五分类）测定；三是枸橼酸钠抗凝，采用全自动血细胞分析仪（三分类）测定；四是枸橼酸钠抗凝，采用全自动血细胞分析仪（五分类）测定；五是EDTA-K2抗凝后转后枸橼酸钠抗凝管中，采用全自动血细胞分析仪（三分类）测定；六是EDTA-K2抗凝后转后枸橼酸钠抗凝管中，采用全自动血细胞分析仪（五分类）测定。
以上全部操作均严格按照规程要求进行。行以上测定的目的在于比较实验操作、抗凝剂以及分析仪器对测定结果的影响。将第一、三和五次抗凝后的静脉血推血液涂片，用贝索瑞氏血细胞染色液染色，用光学显微镜在油镜下观察血涂片并照相，最后比较测定与观察结果并分析引起差异的原因。
2 结果
首次静脉血EDTA-K2抗凝测定结果为11×10-9/L，远低于参考值100-300×109/L，其余六次的测定结果见表1：
表1 不同的抗凝剂与测定仪器测定的血小板计数结果。
表中EDTA-K2+枸橼酸钠为EDTA-K2抗凝后再采用枸橼酸钠抗凝处理。由表可知，单纯使用EDTA-K2抗凝的血液样本无论是采用三分类还是五分类方法均出现了血小板的假性减少现象；而采用枸橼酸钠和EDTA-K2抗凝后再行枸缘酸钠抗凝的血样则测定结果正常。此外，五分类法测定的所有结果均小于三分类法，这可能是由于仪器的不同或测定误差所致，由于样本量较小，还不能得出确定的结论；EDTA-K2抗凝后转为枸橼酸钠抗凝较单用EDTA-K2抗凝的测定结果偏低，可能是由于枸橼酸钠未将所有由EDTA-K2导致的聚集血小板全部解聚，也可能是由于测定误差所致，受样本量所限，未能得出确定的结论。
血涂片结果如图1：
图中蓝色小点为血小板，从A图中明显可以看到大部分血小板出现了聚集现象，B图未见血小板的聚集，C图血小板大部分散在，但仍有部分聚集。这说明该患者静脉血采用EDTA-K2抗凝后出现了明显的聚集现象，而枸橼酸钠抗凝后未聚集，EDTA-K2抗凝后转后枸橼酸钠抗凝后大部分血小板散在，但仍有部分聚集，这也是导致EDTA-K2抗凝后转后枸橼酸钠抗凝的血小板测定结果偏低的原因。 此外，我们还发现白细胞与血小板间存在着良好的相关性，将不同测定结果的血小板与白细胞作散点图并作趋势线，求算相关系数R，结果如图2。
由图可见，当测定的血小板减少时，白细胞测量结果增大，两者呈明显的负相关（R=0.74），这说明血小板聚集的直径接近白细胞直径，全自动血细胞计数仪误判为白细胞，进而造成患者血小板假性减少和白细胞假性增高，这会给临床诊断造成严重干扰。
3 讨论
自Onder等[1]报道1例EDTA依赖性的血小板减少症（Dependent Pseudothrombocytopenia，PTCP）后，引起了国内外广泛关注。EDTA-PTCP是由于抗凝血在全自动血细胞计数仪上检测时，EDTA盐诱导血小板相互聚集、堆积，发生卫星现象，从而影响血小板计数使结果偏低。目前对EDTA-PTCP的发生机理尚不清楚，可能的原因如下[2-4]：①EDTA-PTCP的发生与血小板表面存在某种隐匿性抗原有关，有研究表明，EDTA可诱导血小板表面糖蛋白GPIIb/IIIa的表达，改变了血小板的形态及其膜表面的某种隐匿性抗原的构象，从而激活细胞膜上的磷酸脂酶A2和磷酸酶C，使血小板膜磷酸水解并释放花生四烯酸、ADP、胶原、凝血酶原、内源性钙离子等等活性物质，这些活性物质又进一步活化血小板纤维蛋白受体，使血小板与纤维蛋白原聚集成团。②与血小板卫星现象有关，血小板卫星现象是由于血小板粘附在细胞周围而得名，是存在于EDTA抗凝血中的一种体外现象。③与一些疾病密切相关，是一些疾病的伴随现象，此现象出现于一些疾病的开始或治疗过程中，随着疾病的好转而消失，多发生于自身免疫性疾病、肺心病、晚期妊娠、肝病、毒血症、癌症等。与本研究病例基本吻合，进一步佐证了其与疾病的相关怀。
采血不当造成假性血小板减少的现象较为常见[5]，一是抽血技术不熟练，难以做到一针到位，造成抽血时间延长，多次的穿刺组织损伤，组织凝血因子混入血液样品中产生小肉眼难辨的小凝块；二是抽血后的处理不当，如混合不均匀会产生局部凝血，也会使血小板测定结果偏低；三是儿童和老年患者血管不充盈且细小，抽血困难，抽血过程稍有不顺便可引起血不板聚集；四是采血样过大，当抗剂被饱和以后就会出现血小板聚集凝血，影响最终的计数结果。对于因采血不当造成的假性血小板减少，检验科应进行相关的宣传教育，让护士了解相关的注意事项并掌握标准的操作规程，以确保采集到合格的检测样品。
疾病因素也是造成血小板假性减少的一个重要因素，无论是电阻抗原理还是光散射原理的全自动血细胞计数仪，其检测血小板均具有一定的阈值，正常的血小板均在些阈值范围内，但当患者的血小板大于上限或小于下限时，仪器会误认为其它细胞或噪音而不计入血小板计数中，从而使血小板计数结果偏低。如巨大血小板综合症、特发性血小板减少性紫癜时血小板体积增大[6]；再生障碍性贫血、脾功能亢进、白血病、败血症等患者常见血小板减少[7]。对于此类患者应手工计数血小板以免误诊。
EDTA-K2是目前公认的血细胞计数抗凝剂，在临床血常数检测中得到了广泛的应用，EDTA-PTCP也并不普遍，其发病率仅为0.09%-0.21%[8，9]，但一旦发生，足以造成对这些患者的误诊误治，给患者及临床治疗工作带来很大困扰。在实际工作中，对临床上无任何出血症状而血小板减少的患者，应及时与医师沟通，加强人工血片的复检，并手工法计数血小板和白细胞以排除EDTA-PTCP。另外，经EDTA抗凝处理的血液样本再经枸橼酸钠抗凝处理后，血小板出现解聚现象，这可能是由于枸橼酸钠能够拮抗EDTA对血小板聚集相关抗原或糖蛋白的作用，最终使血小板解聚，相关的作用机理尚需要进一步的研究证实。
参考文献
[1] Onder O， Weinstcin A， Loyer LW. Pseudothrombocytopenia caused by platelet agglutinins that are reactive in blood anticoagulated with chelating ageats[J]. Blood， 1980， 56： 177-182
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[5] Tietz M. Immune responsiveness in orthopedic surgery patients after transfusion of autologous or allergenic blood[ J]. Transfusion， 1995， 35（5）： 378-383
[6] Bizzaro N. EDTA-dependent pseudothrombocytopenia： a clinical and epidemiological study of 11 cases with 10-year follow up [J]. Am J Hematol， 1995， 50（2）： 103-109
[7] 王振义，李家增，阮长耿.血栓与止血基础理论与临床[M].上海：上海科技出版社，1996：227-237
[8] Kurata Y， Havashi S， Iouzaki K， et al. Four cases of pseudothrombocytopenia due to platelet cold agglutinins[J]. Rinsho Ketsueki， 2006， 47（8）： 781-786
[9] 邝妙欢，陆霄云，钟义富，等.假性血小板减少的相关因素[J].中山大学学报（医学科学版），2009，30（8）：121-124