【摘 要】
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[目的]构建表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的重组猪痘病毒(recombinant Swinepox viruis,rSWPV),制备抗GFP单克隆抗体.[方法]首先合成3\'-端含His标签的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)序列EGFP-His,用双酶切方法将其插入到基础质粒载体pSW中,构建重组转移载体pSW-EGFP-His;采用脂质体转染的方法使该载体与SWPV(SWPV-JX20G株)同源重组,经蚀斑纯化获得rSWPV-EGFP-His.重组病毒进
【机 构】
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江西农业大学动物科学技术学院,南昌330045
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[目的]构建表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的重组猪痘病毒(recombinant Swinepox viruis,rSWPV),制备抗GFP单克隆抗体.[方法]首先合成3\'-端含His标签的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)序列EGFP-His,用双酶切方法将其插入到基础质粒载体pSW中,构建重组转移载体pSW-EGFP-His;采用脂质体转染的方法使该载体与SWPV(SWPV-JX20G株)同源重组,经蚀斑纯化获得rSWPV-EGFP-His.重组病毒进行PCR和SDS-PAGE鉴定,扩增并纯化EGFP-His蛋白免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌抗GFP特异性抗体的杂交瘤细胞,制备腹水,对抗GFP单克隆抗体进行效价及特异性鉴定.[结果]PCR和SDS-PAGE结果显示,成功构建并纯化到rSWPV-EGFP-His,该病毒感染PK15细胞可稳定表达EGFP-His蛋白,蛋白大小约27 ku,为可溶性表达,镍柱纯化的EGFP-His蛋白溶液呈明显的绿色.EGFP-His蛋白免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠血清抗体效价高达1 ∶ 256 000.采用杂交瘤技术制备了 9株能稳定分泌抗EGFP-His单克隆抗体的杂交瘤细胞株,间接ELISA和Western blotting结果显示,9株单克隆抗体中的7株针对GFP的线性表位,另外2株单克隆抗体针对GFP的构象表位.[结论]本研究成功制备了 EGFP-His蛋白和9株抗EGFP-His的单克隆抗体,为后续建立GFP的免疫学检测方法提供了必备材料.
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