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摘 要： 以23组同源二倍体和四倍体西瓜为试验材料，在幼苗1叶1心时期用伤根法接种枯萎病菌生理小种1，比较二倍体和四倍体西瓜苗期枯萎病抗性差异。鉴定结果显示，除了‘浙2选’四倍体西瓜发病指数为72，对枯萎病菌生理小种1表现为轻抗外，其余二倍体和四倍体组合均为感病类型。与二倍体西瓜相比，四倍体幼苗发病时间明显滞后，发病症状较轻，四倍体比二倍体抗枯萎病，在‘Yu15’‘黄枚’‘郑州3号’‘返祖1号’‘89选9’‘小红玉’等不同倍性组合间的枯萎病抗性差异尤为明显。这些苗期鉴定结果可以为多倍体西瓜抗病育种提供参考。
关键词： 西瓜；多倍体；枯萎病；抗病鉴定
Abstract： In order to identify the Fusarium wilt disease resistance of diploid and tetraploid watermelon seedlings， 23 groups of diploid and homotetraploid watermelon were used as materials， the root injury method was applied to inoculate Fusarium oxysporum f. sp. niveum race 1. The results showed that all the watermelon seedlings were susceptible types except for tetraploid ‘Zhe 2 xuan’ variety which disease index was 72. Compared with the diploid， wilt disease were late in homotetraploid seedlings， and the symptoms were lighter， especially in ‘Yu15’， ‘Huangmei’， ‘Zhengzhou No. 3’， ‘Fanzu No. 1’， ‘89Xuan9’， ‘Xiaohongyu’ and so on， the tetraploid watermelon seedlings were more resistant to Fusarium wilt than diploid ones. These results could provide reference for the disease resistance breeding of polyploid watermelon.
Key words： Watermelon；Polyploid；Fusarium wilt；Disease identification
我國是西瓜（Citrullus lanatus）产业大国，种植面积183万hm2，占世界西瓜生产面积的60%，总产量的73%[1]。由于近年来我国西瓜种植产业的调整，温室及大棚西瓜栽培面积不断增加，农户的种植方式单一化，西瓜重茬栽培比较普遍，所以西瓜枯萎病的发病情况有逐年加重的趋势，在西瓜主产区发病较为严重。瓜类枯萎病是由镰刀菌属尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）引起的[2]一种危害极为严重的土传病害，在世界各地均有发生，发病时叶片萎蔫，初期尚可恢复正常，发病后期整株枯死，严重可能导致整片西瓜绝产[3]。由于该病原菌可以在土壤中存活10年以上，而且小种也会不断发生变异，因此西瓜枯萎病的防治比较困难，严重影响了西瓜产业的发展，而选育抗病西瓜品种是解决这一问题的有效方法之一。
多倍体化在植物进化中具有重要地位，前人的研究发现，多倍体在耐热[4-6]、抗寒[6-8]、耐盐[9]、抗病[10-13]等方面均表现出一定的优势。刘文革等[14]对不同染色体倍性的西瓜枯萎病抗病性进行了研究，结果显示，同源四倍体及同源三倍体西瓜对枯萎病的抗病能力优于其同源二倍体，可连种多茬。笔者在此基础上，选用中国农业科学院郑州果树研究所多倍体西瓜遗传育种课题组诱变的多组四倍体西瓜及其同源二倍体为试验材料，通过伤根法接种枯萎病菌进行苗期枯萎病抗性鉴定，比较不同倍性西瓜间的抗性差异，为后续多倍体西瓜抗病育种提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
所用试验材料为23组二倍体及其人工诱导的同源四倍体西瓜，抗病和感病对照品种分别为‘Sugarlee’（R）‘Suger Baby’（S）。枯萎病菌生理小种1由浙江大学生物技术研究所宋凤鸣教授惠赠。试验于2017年5月在中国农业科学院郑州果树研究所智能型温室中进行。二倍体及四倍体材料均由中国农业科学院郑州果树研究所多倍体西瓜遗传育种课题组提供（详见表2）。二倍体均为高代自交纯合单系，四倍体由0.2%的秋水仙素诱导二倍体幼苗生长点获得，之后连续自交6代，进行孕性恢复，性状稳定。
1.2 方法
1.2.1 西瓜幼苗的培养 挑选均匀一致的西瓜种子进行人工破壳，于55 ℃温汤浸种2 h后，用湿毛巾包好，放置在30 ℃培养箱中培养24 h，取出发芽整齐的种子播种至已经浇透水的育苗专用基质中，覆土并覆膜保湿，待80%幼苗破土后，去膜适当通风，并及时进行脱帽。控制幼苗在相对湿度为50%、温度28 ℃、16 h/8 h光暗交替的环境中生长。
1.2.2 伤根法接种 枯萎病菌接种参考Song等[15]的方法，略有改动。西瓜苗生长至1叶1心时，选取生长一致的幼苗用清水洗净根表，此过程尽量不要伤害植物根系，用消毒过的剪刀剪去根长的1/3，置于浓度为106个·mL-1分生孢子悬液中浸根15 min，之后移栽至新的培养基质中，继续用不少于40 mL的分生孢子悬液灌根处理。覆膜保湿3 d，之后放置在28 ℃的环境中生长。 1.2.3 枯萎病发病统计 试验分别以‘Sugarlee’和‘Suger Baby’作为抗病和感病对照品种，对‘郑州3号’二倍体及同源四倍体进行苗期枯萎病接种鉴定，每一组材料设置30株重复。接种3 d后每天下午记录发病情况，并统计发病等级。枯萎病的抗性评价标准见表1，等级的划分参照Martyn等[16]的分级标准，具体如下：
0级，无明显发病症状，与对照幼苗无差异；
1级，植株叶片出现黄化，子叶和叶片轻微萎蔫；
2级，一片真叶萎蔫或子叶严重萎蔫；
3级，子叶及60%以上真叶萎蔫，不能恢复正常；
4级，整株萎蔫，60%以上枯死，但心叶仍成活；
5级，整株枯死；
发病指数=（∑（发病等级×该发病等级下幼苗株数）×100）/（5×调查总株数）。
2 结果与分析
采用苗期伤根浸根法接种枯萎病菌生理小种1，对23组同基因型不同倍性（二倍体、四倍体）的西瓜进行枯萎病苗期鉴定，结果如表2所示，感病寄主‘Suger Baby’发病指数97.1，抗病寄主‘Sugarlee’发病指数为13.3，对照品种在本试验中鉴定结果正常。不同品种西瓜的鉴定结果显示，接种16 d后除了‘浙2选’四倍体对枯萎病菌生理小种1表现为轻抗外，其余二倍体和四倍体组合均为感病类型。
比较二倍体与同源四倍体西瓜幼苗发病情况发现，接种枯萎病菌4 d及7 d后23组二倍体西瓜幼苗发病指数均比四倍体高。图2所示为部分二倍体和其同源四倍体接种枯萎病菌后第7 天的发病情况对比，二倍体西瓜幼苗已经严重萎蔫，而四倍体的发病症状并不明显，此时以‘Yu15’差异最为明显，二倍体发病指数为85.7，四倍体发病指数为29.5。接种10 d后，除了‘冰糖脆’‘ED2号’‘XYXB’外，其他四倍体依然具有一定的枯萎病抗病优势。相比二倍体，四倍体幼苗发病时间明显滞后，发病症状较轻，尤其在‘Yu15’‘黄枚’‘郑州3号’‘返祖1号’‘89选9’‘小红玉’等不同倍性组合间差异明显。
3 讨论与结论
西瓜枯萎病抗性鉴定的研究中常以‘Suger Baby’‘Sugarlee’等为鉴定寄主，本试验鉴定结果显示，‘Suger Baby’为感病品种，发病指数为97.1，与耿丽华等[17]的鉴定结果95%接近。‘Sugarlee’抗枯萎病生理小种1，与羊杏平等[18]的结果一致。不同品种西瓜的鉴定结显示，除了‘浙2选’四倍体外其余材料鉴定均为感病品种，推测可能是因为栽培品种中的抗病品种资源较少，建议在多倍体育种过程中应注重抗病品种的筛选，培育兼抗枯萎病的优质品种。
笔者研究发现，与二倍体相比四倍体幼苗发病时间滞后，发病症状明显较轻，四倍体有明显的抗枯萎病优势。多倍体在植物进化中具有重要的地位，正因为多倍体的抗逆性，使得遗传稳定的多倍体能在植物中普遍存在。前人的大量的研究發现，多倍体与其同源二倍体祖先相比具有更高的抗病能力。刘文革等[14]对不同染色体倍性的西瓜枯萎病抗病性进行了研究，结果显示，同源四倍体及同源三倍体对枯萎病的抗病能力均优于其同源二倍体，可连种多茬；四倍体甘蓝型油菜、香蕉等表现出更高的溃疡病、叶斑病的抗性[10-12]。张弛[13]在猕猴桃上的研究发现，二倍体植株在接种溃疡病菌后3 d内感病，四倍体植株在接种病菌后5 d感病。与笔者的研究观点一致，均表明四倍体的抗病性强于其同源二倍体。但由于苗期枯萎病鉴定时选用的菌液与田间相比浓度较高，接种后期四倍体大部分表现为感病，与田间表现有一定的差距，以上不同倍性西瓜材料田间抗病性的对比还有待进一步研究。
参考文献
[1] 刘文革，何楠，赵胜杰，等.我国西瓜品种选育研究进展[J].中国瓜菜，2016，29（1）：1-7.
[2] MARTYN R D，NETZER D.Resistance to races 0，1，and 2 of Fusarium wilt of watermelon in Citrullus sp.PI-296341-FR[J].HortScience，1991，26（4）：429-432.
[3] ZHANG Z，ZHANG J，WANG Y，et al.Molecular detection of Fusarium oxysporum f.sp.niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil[J].FEMS Microbiology Letters，2005，249（1）：39-47.
[4] MADLUNG A.Polyploidy and its effect on evolutionary success：old questions revisited with new tools[J].Heredity，2013，110（2）：99-104.
[5] XIONG Y C，LI F M，ZHANG T.Performance of wheat crops with different chromosome ploidy：root-sourced signals，drought tolerance，and yield performance[J].Planta，2006，224（3）：710-718.
[6] SOLTIS P S，SOLTIS D E.The role of genetic and genomic attributes in the success of polyploids[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2000，97（13）：7051-7057. [7] OTTO S P.The evolutionary consequences of polyploidy[J].Cell，2007，131（3）：452-462.
[8] 刘文革，王鸣，阎志红，等.冷锻炼对不同倍性西瓜幼苗SOD、POD活性及MDA含量的影响[J].西北植物学报，2004，24（4）：578-582.
[9] 朱红菊，刘文革，赵胜杰，等.NaCl胁迫对不同倍性西瓜幼苗Na 、K 和Ca2 质量分数的影响[J].西北农业学报，2014，23（3）：151-158.
[10] ORTIZ R，VULYSTEKE D.Inheritance of black sigatolus disease resistance in Plantain-banana（Musa spp.） hybrids[J].Theoretical and applied geneties.1994，89（2/3）：146-152.
[11] WEI D，MEI J，FU Y，et al.Quantitative trait loci analyses for resistance to Sclerotinia sclerotiorum and flowering time in Brassica napus[J].Molecular breeding，2014，34（4）：1797-1804.
[12] BERLINE F F，CYRIL F，GILLES L，et al.Comparative genomic analysis of duplicated homoeologous regions involved in the resistance of Brassica napus to stem canker[J].Frontiers in Plant Science，2015，6：1-13.
[13] 張弛.红阳猕猴桃四倍体诱导及其抗溃疡病特性初探[D].重庆：西南大学，2011.
[14] 刘文革，阎志红，赵胜杰，等.不同染色体倍性西瓜对枯萎病的抗性研究[J].长江蔬菜，2009（18）：19-20.
[15] SONG Q，LI D，DAI Y，et al.Characterization，expression patterns and functional analysis of the MAPK and MAPKK genes in watermelon （Citrullus lanatus）[J].BMC plant biology，2015，15（1）：298.
[16] MARTYN R D.An Initial Survey of the United States for Races of Fursarium oxysporum f.sp.niveum[J].HortScience，1989，24（4）：696-698.
[17] 耿丽华，郭绍贵，吕桂云，等.西瓜枯萎病菌生理小种鉴定技术体系的建立和验证[J].中国蔬菜，2010（20）：52-56.
[18] 羊杏平，姚怀莲，刘广，等.西瓜品种枯萎病抗性的遗传研究[J].江苏农业学报，2008，24（6）：882-887.
关键词： 西瓜；多倍体；枯萎病；抗病鉴定
Abstract： In order to identify the Fusarium wilt disease resistance of diploid and tetraploid watermelon seedlings， 23 groups of diploid and homotetraploid watermelon were used as materials， the root injury method was applied to inoculate Fusarium oxysporum f. sp. niveum race 1. The results showed that all the watermelon seedlings were susceptible types except for tetraploid ‘Zhe 2 xuan’ variety which disease index was 72. Compared with the diploid， wilt disease were late in homotetraploid seedlings， and the symptoms were lighter， especially in ‘Yu15’， ‘Huangmei’， ‘Zhengzhou No. 3’， ‘Fanzu No. 1’， ‘89Xuan9’， ‘Xiaohongyu’ and so on， the tetraploid watermelon seedlings were more resistant to Fusarium wilt than diploid ones. These results could provide reference for the disease resistance breeding of polyploid watermelon.
Key words： Watermelon；Polyploid；Fusarium wilt；Disease identification
我國是西瓜（Citrullus lanatus）产业大国，种植面积183万hm2，占世界西瓜生产面积的60%，总产量的73%[1]。由于近年来我国西瓜种植产业的调整，温室及大棚西瓜栽培面积不断增加，农户的种植方式单一化，西瓜重茬栽培比较普遍，所以西瓜枯萎病的发病情况有逐年加重的趋势，在西瓜主产区发病较为严重。瓜类枯萎病是由镰刀菌属尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）引起的[2]一种危害极为严重的土传病害，在世界各地均有发生，发病时叶片萎蔫，初期尚可恢复正常，发病后期整株枯死，严重可能导致整片西瓜绝产[3]。由于该病原菌可以在土壤中存活10年以上，而且小种也会不断发生变异，因此西瓜枯萎病的防治比较困难，严重影响了西瓜产业的发展，而选育抗病西瓜品种是解决这一问题的有效方法之一。
多倍体化在植物进化中具有重要地位，前人的研究发现，多倍体在耐热[4-6]、抗寒[6-8]、耐盐[9]、抗病[10-13]等方面均表现出一定的优势。刘文革等[14]对不同染色体倍性的西瓜枯萎病抗病性进行了研究，结果显示，同源四倍体及同源三倍体西瓜对枯萎病的抗病能力优于其同源二倍体，可连种多茬。笔者在此基础上，选用中国农业科学院郑州果树研究所多倍体西瓜遗传育种课题组诱变的多组四倍体西瓜及其同源二倍体为试验材料，通过伤根法接种枯萎病菌进行苗期枯萎病抗性鉴定，比较不同倍性西瓜间的抗性差异，为后续多倍体西瓜抗病育种提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
所用试验材料为23组二倍体及其人工诱导的同源四倍体西瓜，抗病和感病对照品种分别为‘Sugarlee’（R）‘Suger Baby’（S）。枯萎病菌生理小种1由浙江大学生物技术研究所宋凤鸣教授惠赠。试验于2017年5月在中国农业科学院郑州果树研究所智能型温室中进行。二倍体及四倍体材料均由中国农业科学院郑州果树研究所多倍体西瓜遗传育种课题组提供（详见表2）。二倍体均为高代自交纯合单系，四倍体由0.2%的秋水仙素诱导二倍体幼苗生长点获得，之后连续自交6代，进行孕性恢复，性状稳定。
1.2 方法
1.2.1 西瓜幼苗的培养 挑选均匀一致的西瓜种子进行人工破壳，于55 ℃温汤浸种2 h后，用湿毛巾包好，放置在30 ℃培养箱中培养24 h，取出发芽整齐的种子播种至已经浇透水的育苗专用基质中，覆土并覆膜保湿，待80%幼苗破土后，去膜适当通风，并及时进行脱帽。控制幼苗在相对湿度为50%、温度28 ℃、16 h/8 h光暗交替的环境中生长。
1.2.2 伤根法接种 枯萎病菌接种参考Song等[15]的方法，略有改动。西瓜苗生长至1叶1心时，选取生长一致的幼苗用清水洗净根表，此过程尽量不要伤害植物根系，用消毒过的剪刀剪去根长的1/3，置于浓度为106个·mL-1分生孢子悬液中浸根15 min，之后移栽至新的培养基质中，继续用不少于40 mL的分生孢子悬液灌根处理。覆膜保湿3 d，之后放置在28 ℃的环境中生长。 1.2.3 枯萎病发病统计 试验分别以‘Sugarlee’和‘Suger Baby’作为抗病和感病对照品种，对‘郑州3号’二倍体及同源四倍体进行苗期枯萎病接种鉴定，每一组材料设置30株重复。接种3 d后每天下午记录发病情况，并统计发病等级。枯萎病的抗性评价标准见表1，等级的划分参照Martyn等[16]的分级标准，具体如下：
0级，无明显发病症状，与对照幼苗无差异；
1级，植株叶片出现黄化，子叶和叶片轻微萎蔫；
2级，一片真叶萎蔫或子叶严重萎蔫；
3级，子叶及60%以上真叶萎蔫，不能恢复正常；
4级，整株萎蔫，60%以上枯死，但心叶仍成活；
5级，整株枯死；
发病指数=（∑（发病等级×该发病等级下幼苗株数）×100）/（5×调查总株数）。
2 结果与分析
采用苗期伤根浸根法接种枯萎病菌生理小种1，对23组同基因型不同倍性（二倍体、四倍体）的西瓜进行枯萎病苗期鉴定，结果如表2所示，感病寄主‘Suger Baby’发病指数97.1，抗病寄主‘Sugarlee’发病指数为13.3，对照品种在本试验中鉴定结果正常。不同品种西瓜的鉴定结果显示，接种16 d后除了‘浙2选’四倍体对枯萎病菌生理小种1表现为轻抗外，其余二倍体和四倍体组合均为感病类型。
比较二倍体与同源四倍体西瓜幼苗发病情况发现，接种枯萎病菌4 d及7 d后23组二倍体西瓜幼苗发病指数均比四倍体高。图2所示为部分二倍体和其同源四倍体接种枯萎病菌后第7 天的发病情况对比，二倍体西瓜幼苗已经严重萎蔫，而四倍体的发病症状并不明显，此时以‘Yu15’差异最为明显，二倍体发病指数为85.7，四倍体发病指数为29.5。接种10 d后，除了‘冰糖脆’‘ED2号’‘XYXB’外，其他四倍体依然具有一定的枯萎病抗病优势。相比二倍体，四倍体幼苗发病时间明显滞后，发病症状较轻，尤其在‘Yu15’‘黄枚’‘郑州3号’‘返祖1号’‘89选9’‘小红玉’等不同倍性组合间差异明显。
3 讨论与结论
西瓜枯萎病抗性鉴定的研究中常以‘Suger Baby’‘Sugarlee’等为鉴定寄主，本试验鉴定结果显示，‘Suger Baby’为感病品种，发病指数为97.1，与耿丽华等[17]的鉴定结果95%接近。‘Sugarlee’抗枯萎病生理小种1，与羊杏平等[18]的结果一致。不同品种西瓜的鉴定结显示，除了‘浙2选’四倍体外其余材料鉴定均为感病品种，推测可能是因为栽培品种中的抗病品种资源较少，建议在多倍体育种过程中应注重抗病品种的筛选，培育兼抗枯萎病的优质品种。
笔者研究发现，与二倍体相比四倍体幼苗发病时间滞后，发病症状明显较轻，四倍体有明显的抗枯萎病优势。多倍体在植物进化中具有重要的地位，正因为多倍体的抗逆性，使得遗传稳定的多倍体能在植物中普遍存在。前人的大量的研究發现，多倍体与其同源二倍体祖先相比具有更高的抗病能力。刘文革等[14]对不同染色体倍性的西瓜枯萎病抗病性进行了研究，结果显示，同源四倍体及同源三倍体对枯萎病的抗病能力均优于其同源二倍体，可连种多茬；四倍体甘蓝型油菜、香蕉等表现出更高的溃疡病、叶斑病的抗性[10-12]。张弛[13]在猕猴桃上的研究发现，二倍体植株在接种溃疡病菌后3 d内感病，四倍体植株在接种病菌后5 d感病。与笔者的研究观点一致，均表明四倍体的抗病性强于其同源二倍体。但由于苗期枯萎病鉴定时选用的菌液与田间相比浓度较高，接种后期四倍体大部分表现为感病，与田间表现有一定的差距，以上不同倍性西瓜材料田间抗病性的对比还有待进一步研究。
参考文献
[1] 刘文革，何楠，赵胜杰，等.我国西瓜品种选育研究进展[J].中国瓜菜，2016，29（1）：1-7.
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[4] MADLUNG A.Polyploidy and its effect on evolutionary success：old questions revisited with new tools[J].Heredity，2013，110（2）：99-104.
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[10] ORTIZ R，VULYSTEKE D.Inheritance of black sigatolus disease resistance in Plantain-banana（Musa spp.） hybrids[J].Theoretical and applied geneties.1994，89（2/3）：146-152.
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[12] BERLINE F F，CYRIL F，GILLES L，et al.Comparative genomic analysis of duplicated homoeologous regions involved in the resistance of Brassica napus to stem canker[J].Frontiers in Plant Science，2015，6：1-13.
[13] 張弛.红阳猕猴桃四倍体诱导及其抗溃疡病特性初探[D].重庆：西南大学，2011.
[14] 刘文革，阎志红，赵胜杰，等.不同染色体倍性西瓜对枯萎病的抗性研究[J].长江蔬菜，2009（18）：19-20.
[15] SONG Q，LI D，DAI Y，et al.Characterization，expression patterns and functional analysis of the MAPK and MAPKK genes in watermelon （Citrullus lanatus）[J].BMC plant biology，2015，15（1）：298.
[16] MARTYN R D.An Initial Survey of the United States for Races of Fursarium oxysporum f.sp.niveum[J].HortScience，1989，24（4）：696-698.
[17] 耿丽华，郭绍贵，吕桂云，等.西瓜枯萎病菌生理小种鉴定技术体系的建立和验证[J].中国蔬菜，2010（20）：52-56.
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