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摘要 [目的]分离并鉴定鱼嗜水气单胞菌，并构建系统发育分析。[方法]从云南某鱼场采集发病鱼的病变组织进行细菌分离与培养，并对分离菌株进行初步鉴定、16S rDNA鉴定和系统发育分析。[结果]分离培养到1株细菌，命名为Ah1305。经表型鉴定、生化试验及16S rDNA系统发育分析，鉴定为嗜水气单胞菌。[结论]该研究可为快捷、准确检测鱼嗜水气单胞引起的疾病提供参考。
关键词 嗜水气单胞菌；分离鉴定；16S rDNA
中图分类号 S182；Q93-331 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）13-03907-04
Abstract [Objective] The aim was to isolate and identify Aeromonas hydrophila and establish the phylogeny. [Method] Lesion tissue of fish was collected from a certain farm in Yunnan Province， and then the isolated strain was identified by preliminary identification， 16S rDNA identification and phylogenetic analysis. [Result] The bacteria were isolated and named as Ah1305. Through the morphological identification， biochemical test and 16S rDNA phylogeny analysis， it was identified as Aeromonas hydrophila. [Conclusion] The study can provide reference for quick and accurately test the disease caused by Aeromonas hydrophila.
Key words Aeromonas hydrophila； Isolation and identification； 16S rDNA
致病性嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）属于气单胞菌科（Aermonadaceae）气单胞菌属（Aeromonas），是革兰氏阴性短杆菌，两端钝圆，直或略弯，单个或成双排列，有极端单鞭毛，固体培养基上有周鞭毛，无荚膜，不形成芽孢，最适生长温度为28 ℃。嗜水气单胞菌普遍存在于淡水、海水、污泥、淤泥以及土壤中，是一种人畜共患病的病原。患病鱼出现烂尾、鳍充血，导致出血性败血症和流行性溃疡综合症（EUS）等症状[1-2]，近些年来有大量的报道表明嗜水气单胞菌还可以引发人类的腹泻、中毒病、外伤性感染以及败血症等病症[3]，其致病作用已引起公众的关注，该菌在国外被作为腹泻病原菌进行检测[4-5]。致病菌株除感染鱼及人类以外，还可以感染多种动物（如两栖类、爬行类、鸟类[6]等），给养殖业和公共卫生带来了巨大损失。
笔者从云南某发病鱼场送检病料中分离到1株细菌，并对其进行表型鉴定及16S rDNA鉴定，以期为鱼场该病的检测与防治提供科学依据[7-11]。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1
病料。采集云南省某鱼场发病鱼。将发病症状明显的鱼无菌解剖，取病变明显的肝脏、脾脏及肌肉，4 ℃下保存。
1.1.2
培养基。TSA培养基，购自北京路桥技术有限责任公司。糖类发酵等生化管，购自杭州天和微生物试剂有限公司。血液琼脂培养基。
1.1.3
主要试剂及仪器。细菌基因组DNA提取试剂盒（DP2001）、多功能DNA纯化回收试剂盒（DP1501），购自BIOTEKE公司。TaKaRa rTaq DNA酶、DL2000 Marker，购自宝生物工程（大连）有限公司。凝胶成像仪、PCR扩增仪，购自BIO-RAD公司，电泳仪购自北京六一仪器厂。
1.2 方法
1.2.1
分离培养。将病鱼体表消毒，无菌取病变组织，剪碎研磨。用无菌生理盐水对病料进行10倍稀释，分别接种于TSA培养基和血液琼脂培养基，置于28 ℃培养24 h。观察菌落形态，挑取灰白色发生溶血的可疑单菌落进行革兰氏染色。将染色中有阴性短杆菌的菌落在TSA培养基和血液琼脂培养基上分离与纯化。
1.2.2
形态观察。将分离纯化后的细菌按照常规方法进行革兰氏染色并镜检。
1.2.3
生理生化试验。将纯培养的分离菌接种于生化培养基，进行各种糖发酵试验、精氨酸双水解酶试验、硫化氢试验、明胶液化试验、硝酸盐还原试验，28 ℃下培养24～48 h，记录培养结果。
1.2.4
分子生物学鉴定。
（1）引物设计。参照GenBank已发表的16S rDNA序列设计1对引物，上游引物：27F（5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’），下游引物：1492R（5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’）。引物由上海生工生物技术工程有限公司合成。
（2）制备模板：将分离菌株用TSA液体培养基培养至对数生长期，按照细菌DNA提取试剂盒说明书步骤操作，提取细菌总DNA。
（3）PCR反应体系：TaKaRa rTaq（5 U/μl） 0.5 μl、10×PCR Buffer 3 μl、2.5 mmol/L dNTP Mixture 2.5 μl、上游引物0.5 μl（10 pmol/L）、下游引物0.5 μl（10 pmol/L）、模板DNA 2 μl（50 ng）、灭菌双蒸水21 μl、共30 μl。 PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃ 8 min，4 ℃保存，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。
按照DNA纯化（胶回收）试剂盒说明书操作步骤对PCR产物进行纯化，并送交华大基因测序。
1.2.5
系统发育树的构建。用BLAST将分离株的16S rDNA测序结果与GenBank中登录的序列进行比对，并选取19株作为参比序列。将分离株序列与参比序列使用软件DNAMAN进行同源性分析，计算同源性数值。使用MEGA 5.0软件构建系统发育树，分析分离株与参比株的亲缘关系，鉴定分离株的种属。参比序列的名称、登录号、登录时间、分离来源及分离地区见表1。
2 结果与分析
2.1 培养特性
通过细菌分离，得到1株细菌，命名为Ah1305。在TSA固体培养基上，形成半透明、圆形、中央凸起、边缘光滑的小菌落，直径在1 mm左右。在血液琼脂培养基上形成灰白色的菌落，产生β型溶血圈（图1）。
2.2 细菌形态
3 讨论
在临床上鱼类的细菌病中，很多具有共同的症状（如体表充血、发红、溃烂、腹部膨大、腹水等），只依靠临床症状来判断及治疗有很大盲目性，需要通过实验室诊断才能确诊[12]。实验室鉴定鱼类细菌性疾病病原的方法有很多，主要包括生理生化特性鉴定技术（如用ATB细菌鉴定仪）[13-14] 、免疫学诊断技术（如间接ELISA）[15-16]、分子生物学方法[17-20]（如LAMP）[21-22]等。PCR检测方法简便快捷，已被较多应用于嗜水气单胞菌的快速检测。检测的目的基因也有多种，如溶血素基因[23-24]、气溶素基因[25]、丝氨酸蛋白酶基因[26]、16S rDNA[27-28]等。
以16S rDNA为目的基因的PCR鉴定方法最为成熟，也取得了较显著的成果。与表形鉴定、生理生化鉴定等传统的细菌鉴定方法相比，该方法操作简便，省时，且避免了传统生化试验的不稳定性。与针对其他基因的PCR鉴定方法相比，16S rDNA基因具有高度保守性的特点，稳定性好，可靠性高。对于混合感染的病例，可做到一次检测多种病原菌。该方法方便快捷，成本较低，准确性高，对于症状相似的疾病能够做到准确、快速鉴定病原菌，从而指导临床治疗，避免因误诊而造成的损失。
参考文献
[1] GORDEN R W，HAZEN T C，ESCH G W，et al.Isolation of Aeromonas hydrophila from Ameirican alligator，Alligator mississippiensis[J].J Wildlife Dis，1979，15（2）：239-243.
[2] HOSSAIN M.Isolation of pathogenic bacteria from the skin ulcerous symptomatic gourami （Colisa lalia） through 16S rDNA analysis[J].Univer J Zool，Rajshahi Univer，2008，27（12）：21-24.
[3] 叶方友，江夏明，王琳娜.一起嗜水气单胞菌感染导致群体性腹泻的调查[J].中华流行病学杂志，2004，25（5）：406.
[4] 胡萌，潘子豪，陆承平，等.嗜水气单胞菌流行菌株的生物学特性[J].中国兽医科学，2013，43（05）：441-445.
[5] JANDA J M，ABBOTT S L.The genus Aeromonas：taxonomy，pathogenicity，and infection[J].Clin Microbiol Rev，2010，23（1）：35-73.
[6] 冷闯，邓舜洲，张文波，等.中华鳖致病性嗜水气单胞菌的分离鉴定及药敏试验[J].动物医学进展，2012，33（2）：124-129.
[7] 陈雪，李太元，常巧城，等.林蛙红腿病PCR诊断方法的建立[J].兽医科技报，2009（5）：82-83.
[8] 韦信贤，杨先乐，童桂香，等.四重PCR检测致病性嗜水气单胞菌[J].中国人兽共患病学报，2013，29（6）：587-593.
[9] MENG S，BAI XM，WANG Y，et al.Novel triplex realtime Taq-Man PCR assay for the detection of Aeromonas hydrophila[J].Chin J Zoonoses，2012，28（3）：217-222.
[10] Jumpstart Consortium Human Microbiome Project Data Generation Working Group.Evaluation of 16S rDNAbased community profiling for human microbiome research[J].PLOS One，2012，7（6）：39315.
[11] JACOB D，WAHAB T，EDVINSSON B，et al.Identification and subtyping of Francisella by pyrosequencing and signature matching of 16S rDNA fragments[J].Lett Appl Microbiol，2011，53（6）：592-595.
[12] 张磊，管越强，李艳琴，等.患病罗汉鱼疑似病原菌分离鉴定与药敏试验[J].安徽农业科学，2009，37（7）：3020-3022. [13] 曹海鹏，何珊，刘丽玲，等.鲟源病原性嗜水气单胞菌拮抗芽孢杆菌的鉴定及其生物学特性[J].微生物学通报，2011，38（9）：1377-1384.
[14] HORVAT RT，EL ATROUNI W，HAMMOUD K，et al.Ribosomal RNA sequence analysis of Brucella in-fection misidentified as Ochrobactrum anthropi infection[J].J Clin Microbiol，2011，49（3）：1165-1168.
[15] 王璐，梁利国，谢骏，等.嗜水气单胞菌双重PCR检测方法的建立及应用[J].水产科学，2013，32（4）：199-223.
[16] 辛志明，樊海平，吴斌，等.嗜水气单胞菌胶体金快速检测试纸条的研制[J].中国兽医科学，2012，42（7）：708-712.
[17] 白雪梅，李太元，杨兴，等.应用间接荧光抗体技术检测林蛙嗜水气单胞菌[J].水产科学，2010，29（10）：613-615.
[18] PICOZZI C，BONACINA G，VIGENTINI I，et al.Genetic diversity in italian Lactobacillus sanfranciscensis strains assessed by Multilocus sequence typing and Pulsed-field gel electrophoresis analyses[J].Microbiology，2010，156：2035-2045.
[19] ZHOU H，LOTTNER S，GANTER M，et al.Identification of two new Dichelobacter nodosus strains in Germany[J].Veterinary Journa，2010，184（1）：115-117.
[20] WRY N，MONTEIL C，POURCHER A M，et al.Humanspecific fecal bacteria in wastewater treatment plant effluents[J].Water Rsearch，2010，44（6）：1873-1883.
[21] NOTOMI T.Loopmediated isothermal amplification[J].Nippon Rinsho，2007，65（5）：957-961.
[22] 曾桂芬，龙北国，姜容，等.LAMP和PCR法检测痢疾志贺菌的特异性和灵敏性比较[J].热带医学杂志，2012，12（5）：547-549，592.
[23] 王蓉，王忠发，王志铮，等.实时荧光定量 PCR 快速检测嗜水气单胞菌方法的建立[J].现代预防医学，2012，39（13）：3339-3341.
[24] GOSWARNI R，GHOSH D，SAHA D R，et al.Effect of acute and chronic arsenic exposure on growth，structure and virulence of Aeromonas hydrophila isolated from fish[J].Microbial Pathogenesis，2011，50（2）：63-69.
[25] 朱建萍，叶展翔，朱烨，等.嗜水气单胞菌气溶素毒力基因检测研究[J].中国热带医学，2009，9（5）：810-811.
[26] 单小枫，郭伟生.嗜水气单胞菌检测技术研究进展[J].动物医学进展，2010，31（5）：90-93.
[27] KOMMEDAL O，SIMMON K，KARACA D，et al.Dual priming oligonucleotides for broadrang amplification of the bacterial 16S rDNA gen directly from humanclinical specimens[J].J Clin Microbiol，2012，50（4）：1289-1294.
[28] MAHLEN S D，CLARRIDGE J E .Evaluation of a selectionstrategy before use of 16S rRNA gene sequencing for theidentification of clinically significant Gramnegative rods and coccobacilli[J].Am J Clin Pathol，2011，136（3）：381-388.
关键词 嗜水气单胞菌；分离鉴定；16S rDNA
中图分类号 S182；Q93-331 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）13-03907-04
Abstract [Objective] The aim was to isolate and identify Aeromonas hydrophila and establish the phylogeny. [Method] Lesion tissue of fish was collected from a certain farm in Yunnan Province， and then the isolated strain was identified by preliminary identification， 16S rDNA identification and phylogenetic analysis. [Result] The bacteria were isolated and named as Ah1305. Through the morphological identification， biochemical test and 16S rDNA phylogeny analysis， it was identified as Aeromonas hydrophila. [Conclusion] The study can provide reference for quick and accurately test the disease caused by Aeromonas hydrophila.
Key words Aeromonas hydrophila； Isolation and identification； 16S rDNA
致病性嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）属于气单胞菌科（Aermonadaceae）气单胞菌属（Aeromonas），是革兰氏阴性短杆菌，两端钝圆，直或略弯，单个或成双排列，有极端单鞭毛，固体培养基上有周鞭毛，无荚膜，不形成芽孢，最适生长温度为28 ℃。嗜水气单胞菌普遍存在于淡水、海水、污泥、淤泥以及土壤中，是一种人畜共患病的病原。患病鱼出现烂尾、鳍充血，导致出血性败血症和流行性溃疡综合症（EUS）等症状[1-2]，近些年来有大量的报道表明嗜水气单胞菌还可以引发人类的腹泻、中毒病、外伤性感染以及败血症等病症[3]，其致病作用已引起公众的关注，该菌在国外被作为腹泻病原菌进行检测[4-5]。致病菌株除感染鱼及人类以外，还可以感染多种动物（如两栖类、爬行类、鸟类[6]等），给养殖业和公共卫生带来了巨大损失。
笔者从云南某发病鱼场送检病料中分离到1株细菌，并对其进行表型鉴定及16S rDNA鉴定，以期为鱼场该病的检测与防治提供科学依据[7-11]。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1
病料。采集云南省某鱼场发病鱼。将发病症状明显的鱼无菌解剖，取病变明显的肝脏、脾脏及肌肉，4 ℃下保存。
1.1.2
培养基。TSA培养基，购自北京路桥技术有限责任公司。糖类发酵等生化管，购自杭州天和微生物试剂有限公司。血液琼脂培养基。
1.1.3
主要试剂及仪器。细菌基因组DNA提取试剂盒（DP2001）、多功能DNA纯化回收试剂盒（DP1501），购自BIOTEKE公司。TaKaRa rTaq DNA酶、DL2000 Marker，购自宝生物工程（大连）有限公司。凝胶成像仪、PCR扩增仪，购自BIO-RAD公司，电泳仪购自北京六一仪器厂。
1.2 方法
1.2.1
分离培养。将病鱼体表消毒，无菌取病变组织，剪碎研磨。用无菌生理盐水对病料进行10倍稀释，分别接种于TSA培养基和血液琼脂培养基，置于28 ℃培养24 h。观察菌落形态，挑取灰白色发生溶血的可疑单菌落进行革兰氏染色。将染色中有阴性短杆菌的菌落在TSA培养基和血液琼脂培养基上分离与纯化。
1.2.2
形态观察。将分离纯化后的细菌按照常规方法进行革兰氏染色并镜检。
1.2.3
生理生化试验。将纯培养的分离菌接种于生化培养基，进行各种糖发酵试验、精氨酸双水解酶试验、硫化氢试验、明胶液化试验、硝酸盐还原试验，28 ℃下培养24～48 h，记录培养结果。
1.2.4
分子生物学鉴定。
（1）引物设计。参照GenBank已发表的16S rDNA序列设计1对引物，上游引物：27F（5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’），下游引物：1492R（5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’）。引物由上海生工生物技术工程有限公司合成。
（2）制备模板：将分离菌株用TSA液体培养基培养至对数生长期，按照细菌DNA提取试剂盒说明书步骤操作，提取细菌总DNA。
（3）PCR反应体系：TaKaRa rTaq（5 U/μl） 0.5 μl、10×PCR Buffer 3 μl、2.5 mmol/L dNTP Mixture 2.5 μl、上游引物0.5 μl（10 pmol/L）、下游引物0.5 μl（10 pmol/L）、模板DNA 2 μl（50 ng）、灭菌双蒸水21 μl、共30 μl。 PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃ 8 min，4 ℃保存，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。
按照DNA纯化（胶回收）试剂盒说明书操作步骤对PCR产物进行纯化，并送交华大基因测序。
1.2.5
系统发育树的构建。用BLAST将分离株的16S rDNA测序结果与GenBank中登录的序列进行比对，并选取19株作为参比序列。将分离株序列与参比序列使用软件DNAMAN进行同源性分析，计算同源性数值。使用MEGA 5.0软件构建系统发育树，分析分离株与参比株的亲缘关系，鉴定分离株的种属。参比序列的名称、登录号、登录时间、分离来源及分离地区见表1。
2 结果与分析
2.1 培养特性
通过细菌分离，得到1株细菌，命名为Ah1305。在TSA固体培养基上，形成半透明、圆形、中央凸起、边缘光滑的小菌落，直径在1 mm左右。在血液琼脂培养基上形成灰白色的菌落，产生β型溶血圈（图1）。
2.2 细菌形态
3 讨论
在临床上鱼类的细菌病中，很多具有共同的症状（如体表充血、发红、溃烂、腹部膨大、腹水等），只依靠临床症状来判断及治疗有很大盲目性，需要通过实验室诊断才能确诊[12]。实验室鉴定鱼类细菌性疾病病原的方法有很多，主要包括生理生化特性鉴定技术（如用ATB细菌鉴定仪）[13-14] 、免疫学诊断技术（如间接ELISA）[15-16]、分子生物学方法[17-20]（如LAMP）[21-22]等。PCR检测方法简便快捷，已被较多应用于嗜水气单胞菌的快速检测。检测的目的基因也有多种，如溶血素基因[23-24]、气溶素基因[25]、丝氨酸蛋白酶基因[26]、16S rDNA[27-28]等。
以16S rDNA为目的基因的PCR鉴定方法最为成熟，也取得了较显著的成果。与表形鉴定、生理生化鉴定等传统的细菌鉴定方法相比，该方法操作简便，省时，且避免了传统生化试验的不稳定性。与针对其他基因的PCR鉴定方法相比，16S rDNA基因具有高度保守性的特点，稳定性好，可靠性高。对于混合感染的病例，可做到一次检测多种病原菌。该方法方便快捷，成本较低，准确性高，对于症状相似的疾病能够做到准确、快速鉴定病原菌，从而指导临床治疗，避免因误诊而造成的损失。
参考文献
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[3] 叶方友，江夏明，王琳娜.一起嗜水气单胞菌感染导致群体性腹泻的调查[J].中华流行病学杂志，2004，25（5）：406.
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[8] 韦信贤，杨先乐，童桂香，等.四重PCR检测致病性嗜水气单胞菌[J].中国人兽共患病学报，2013，29（6）：587-593.
[9] MENG S，BAI XM，WANG Y，et al.Novel triplex realtime Taq-Man PCR assay for the detection of Aeromonas hydrophila[J].Chin J Zoonoses，2012，28（3）：217-222.
[10] Jumpstart Consortium Human Microbiome Project Data Generation Working Group.Evaluation of 16S rDNAbased community profiling for human microbiome research[J].PLOS One，2012，7（6）：39315.
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[14] HORVAT RT，EL ATROUNI W，HAMMOUD K，et al.Ribosomal RNA sequence analysis of Brucella in-fection misidentified as Ochrobactrum anthropi infection[J].J Clin Microbiol，2011，49（3）：1165-1168.
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[16] 辛志明，樊海平，吴斌，等.嗜水气单胞菌胶体金快速检测试纸条的研制[J].中国兽医科学，2012，42（7）：708-712.
[17] 白雪梅，李太元，杨兴，等.应用间接荧光抗体技术检测林蛙嗜水气单胞菌[J].水产科学，2010，29（10）：613-615.
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[21] NOTOMI T.Loopmediated isothermal amplification[J].Nippon Rinsho，2007，65（5）：957-961.
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[23] 王蓉，王忠发，王志铮，等.实时荧光定量 PCR 快速检测嗜水气单胞菌方法的建立[J].现代预防医学，2012，39（13）：3339-3341.
[24] GOSWARNI R，GHOSH D，SAHA D R，et al.Effect of acute and chronic arsenic exposure on growth，structure and virulence of Aeromonas hydrophila isolated from fish[J].Microbial Pathogenesis，2011，50（2）：63-69.
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[28] MAHLEN S D，CLARRIDGE J E .Evaluation of a selectionstrategy before use of 16S rRNA gene sequencing for theidentification of clinically significant Gramnegative rods and coccobacilli[J].Am J Clin Pathol，2011，136（3）：381-388.