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摘要：以吉林市左家镇3个地区的18株野生珊瑚菌样品为研究材料，应用AFLP分子标记方法，分析其遗传多样性水平。结果发现，左家地区珊瑚菌具有较高的遗传多样性，AFLP多态位点百分率为85.4%，遗传距离在0.223～0.712之间，相似系数的变化范围在0.442～0.824之间。应用UPGMA聚类分析表明，所检测的18株野生珊瑚菌样品的遗传距离与采样地点有明显关联，并且ZJ居群野生珊瑚菌的遗传多样性远高于LT居群和FM居群。
关键词：珊瑚菌；AFLP；遗传多样性；遗传分化
基金项目：吉林农业科技学院微生物学重点学科培育项目（吉农院合字〔2013〕第X009号）；吉林农业科技学院大学生科技创新项目（吉农院合字〔2015〕第 041号）
中图分类号： Q75 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.03.022
珊瑚菌（Clavicorona pyxydata），也称“扫帚菌”，属珊瑚菌科（Clavariaceae），其形状多样，颜色鲜艳，是我国野生食用菌中的一种重要资源。而传统医学认为，珊瑚菌具有补钙、镇静的食补功效。有研究表明，珊瑚菌具有抗癌作用，珊瑚菌的水煎剂对体外培养的乳腺癌细胞株有明显的抑制作用，可以作为抗乳腺癌的良好备选药物。珊瑚菌在我国分布广泛，其中常见种有葡萄枝瑚菌、密枝瑚菌、杯珊瑚菌、冠锁瑚菌、须瑚菌、棒瑚菌、平截棒瑚菌等。由于珊瑚菌的高经济价值而且目前尚不能进行商业化栽培，因此目前市场上消费的产品几乎全部来自野生。目前，国内仅对山东省、河南省、秦巴山区和鸡足山地区的野生珊瑚菌进行了资源调查，而有关珊瑚菌遗传多样性结构状况研究尚未开展。在众多分子生物学遗传多样性研究方法中，AFLP分子标记技术具有实验操作简单、快速、高效、遗传多态性高、重复性好等特点，其检测遗传位点效率高于ISSR和SSR等技术。通过AFLP位点遗传多样性分析，可以检测居群的遗传多样性水平；通过遗传多样度、基因多样度各指数的分析可以了解居群的遗传结构和遗传分化；分析群体间的遗传相似性和遗传距离；通过聚类分析获得显示各居群间亲缘关系的进化系统。本研究运用AFLP分子标记技术在分子水平上探讨吉林市左家地区18株的珊瑚菌亲缘关系和遗传多样性，旨在揭示珊瑚菌遗传多样性水平，遗传结构及其遗传分化，为珊瑚菌这一重要食（药）用资源保护与利用奠定理论基础。
1材料与方法
1.1试验材料
从吉林市左家镇三个地区采集18株野生珊瑚菌子实体（三个居群，分别编号为LT1-6，FM1-6和ZJ1-6），样品采集后用硅胶干燥并置于密封袋中。
1.2主要试剂
AFLP接头、预扩增引物和选择性扩增引物由上海生工公司合成；Ex Taq DNA聚合酶、dNTP和DNA ladder Mix购自Takara公司。
1.3珊瑚菌总DNA 的提取
称量珊瑚菌子实体干燥样品0.2克，采用改良的CTAB法[7]提取珊瑚菌基因组DNA，加100μL的TE缓冲液溶解总DNA，-20℃冻存备用。
1.4 AFLP扩增
1.4.1 酶切与接头连接 酶切反应体系为1×T4 ligation buffer，1U EcoRI，1U MseI，100μmol/L EcoRI接头，100μmol/L MseI 接头，1U T4 ligase，200ng基因组DNA，加水补足到总反应体积为30μL。混匀反应体系，在37℃条件下酶切4 小时，继续在16℃条件下连接8 小时后4℃保存。
1.4.2预扩增和选择性扩增 本文所用的预扩增引物和荧光标记的选择性扩增引物由Invitrogen公司合成。预扩增反应体系为25μL，包括1×反应缓冲液，300μmol/L dNTPs，350μmol/L引物，0.5U ExTaq DNA聚合酶，1μL基因组DNA酶切产物作为模板。PCR反应条件为95 ℃预变性5分钟，94℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸90秒，35次循环，72℃延伸10min，4℃保存。预扩增PCR反应产物稀释20倍作为选择性扩增PCR的模板。选择性扩增反应体系为25μL，包括1×反应缓冲液，300μmol/L dNTPs，350μmol/L引物，0.5U ExTaq DNA聚合酶，1μL稀释好的预扩增产物作为模板。PCR反应条件为95 ℃预变性5分钟，94℃变性45秒，65℃退火45秒，72℃延伸90秒，10次循环，每轮循环温度递减1℃，94℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸90秒，35次循环，72℃延伸10分钟，4℃保存。反应产物在1.2%琼脂糖凝胶中电泳 80 V电压下电泳60 分钟，用凝胶成像系统观察照相。
1.4.3AFLP选择性扩增结果的检测与分析 AFLP选择性扩增产物送交长春华大中天生物技术有限公司进行毛细管电泳和荧光信号读取。进行统计AFLP扩增条带时，荧光信号值大于80时认为有条带记录为1，小于80时认为没有条带记录为0。应用NTSYS-pc2.1软件计算样品之间的相似系数，并进行UPGMA聚类分析。根据遗传距离用Mega3.0软件UPGMA法聚类分析构建系统树。
2结果与分析
2.1珊瑚菌的遗传距离和相似系数分析
通过一共从36对选择性扩增的引物组合中读取3227条带，其中多态性条带有2758条（占85.4%）。遗传距离（Genetic Distance）和相似系数（Genetic Identity）是用来衡量种群之间遗传分化程度的重要指标用POPGENE 32软件对吉林市左家镇18株珊瑚菌（3个取样地点）进行遗传距离和相似系数分析，结果见表1。
3个珊瑚菌群间的遗传距离的变化范围在0.223～0.712之间，相似系数的变化范围在0.442～0.824之间。珊瑚菌居群 ZJ与居群FM之间的遗传距离最小，为0.223 相似系数也是最高的为0.824。左家地区珊瑚菌居群 ZJ与居群LT之间的遗传距离最大，为0.712，同样相似系数是最低的，为0.442。 2.2珊瑚菌样品间和居群间的亲缘关系聚类分析
用软件NTSYS-pc 2.1对18个试验样品相似系数进行分析，使用UPGMA法进行聚类分析，结果见图1。
图1表明ZJ-3号和ZJ-5号样品的相似性最大，相似系数为0.79，说明这2个样品的亲缘关系最为接近。聚类图在相似系数约为0.50处可划分为三大组，第1组包括9份资源，组内又可划分2个亚组。第2组包括4份资源。其他分散的样品为LT居群的5份资源，相互之间遗传差异较大。上述结果表明左家地区居群（ZJ）和居群（FM）的亲缘关系近，而居群（LT）与前两者亲缘关系较远。
3结语
随着人们对食用珊瑚菌兴趣的增加，野生珊瑚菌资源受到了巨大的威胁。吉林市左家地区具有丰富的野生珊瑚菌资源，为了了解野生珊瑚菌遗传多样性，避免野生珊瑚菌遗传多样性的散失，本文通过分析左家镇3个地点的18株野生珊瑚菌样品的遗传多样性水平，发现左家珊瑚菌具有较高的遗传多样性，AFLP多态位点百分率为85.4%，高于羊肚菌（79.55%）、松茸（76.92%）和冬虫夏草（69.60%），而低于美味牛肝菌（93.34%）[10]。而野生珊瑚菌遗传相似性的UPGMA聚类图（图1）以及遗传距离和遗传相似性分析（表1）表明左家镇ZJ居群野生珊瑚菌的遗传多样性远高于LT居群和FM居群。这一现象可能表明左家镇的ZJ居群的野生珊瑚菌资源保护较好，而LT居群和FM居群的野生珊瑚菌资源可能因为人类活动已经遭到了一定程度的破坏。
参考文献
[1]常正尧，吴亚楠，李永芳，郭淼，赵静，刘京昇，李效良，齐冰. 珊瑚菌抗乳腺癌作用的研究[J]. 时珍国医国药，2013，（01）：152-154.
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1998，（03）：3.
[3]王法云，崔波，古奕庆，薛金鼎，杨宗亮，朱学凌，贺元超. 河南的珊瑚菌科食用菌资源研究及开发利用 [J].河南科学，1997，（01）：60-67.
[4]李仲贤. 秦巴山区野生珍稀珊瑚菌分离培养研究[J]. 陕西农业科学，2013，（03）：54-55.
[5]苏鸿雁，杨晓霞. 鸡足山珊瑚菌资源调查[J].大理学院学报，2002，（04）：49-50.
[6]穆慧敏，姜华，王艳丽，孙国昌. 研究稻瘟病菌群体遗传多态性的分子标记方法[J]. 中国水稻科学，2013，（05）：545-552.
[7]Saghai-Maroof MA， Soliman， KM Jorgensen RA， et al. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley： Mendelian inheritance， chromosomal location， and population dynamics[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1984， 81（24）：8014-8018.
[8]Yeh FC， Boyle TJB. Population genetic analysis of co-dom
inant and dominant markers and quantitive trait[J]. Belgian Journal of Botany， 1997 （1） ： 129-157.
[9]Kumar S， Tamura K， Nei M. MEGA3： Integrated software for molecular evolutionary genetic analysis and sequence alignment[J]. Briefings in Bioinformatics， 2004， 5 （2） ： 150-163
[10] 刘文丛， 张建博， 桂明英等. 滇西北地区5种羊肚菌遗传多样性的ISSR分析[J]. 中国食用菌， 2011，30（4）： 38-42.
[11] 李华，卫敏，陈俙妍，刘钟栋，梁永波. 珊瑚菌总萜提取工艺研究[J]. 时珍国医国药，2012，（04）：950-951.
[12] 易千红，叶佳明，鲁晓航，何荣军. 珊瑚菌液体发酵条件优化及其胞内多糖的组成研究[J].发酵科技通讯，2013，（02）：18-21.
[13] 郑永标，何佳，吴雅滨，许小萍，庞海月. 珊瑚菌液体发酵工艺优化及其菌丝体的化学成分分析[J]. 食用菌， 2015（06）：7-9.
[14] 王丽娟，张飞，苗玉洁. 珊瑚菌多糖的提取及其对羟自由基的清除作用研究[J]. 食品工业，2012（10）：43-46.
[15] 刘文丛， 张建博， 桂明英，等. 滇西北地区5种羊肚菌遗传多样性的ISSR分析[J]. 中国食用菌， 2011，30（04）：38-42.
作者简介：王凤兰，吉林农业科技学院，本科在读，研究方向：生物工程。
通讯作者：于晓明，硕士，吉林农业科技学院，讲师，研究方向：分子生物学与基因工程。
关键词：珊瑚菌；AFLP；遗传多样性；遗传分化
基金项目：吉林农业科技学院微生物学重点学科培育项目（吉农院合字〔2013〕第X009号）；吉林农业科技学院大学生科技创新项目（吉农院合字〔2015〕第 041号）
中图分类号： Q75 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.03.022
珊瑚菌（Clavicorona pyxydata），也称“扫帚菌”，属珊瑚菌科（Clavariaceae），其形状多样，颜色鲜艳，是我国野生食用菌中的一种重要资源。而传统医学认为，珊瑚菌具有补钙、镇静的食补功效。有研究表明，珊瑚菌具有抗癌作用，珊瑚菌的水煎剂对体外培养的乳腺癌细胞株有明显的抑制作用，可以作为抗乳腺癌的良好备选药物。珊瑚菌在我国分布广泛，其中常见种有葡萄枝瑚菌、密枝瑚菌、杯珊瑚菌、冠锁瑚菌、须瑚菌、棒瑚菌、平截棒瑚菌等。由于珊瑚菌的高经济价值而且目前尚不能进行商业化栽培，因此目前市场上消费的产品几乎全部来自野生。目前，国内仅对山东省、河南省、秦巴山区和鸡足山地区的野生珊瑚菌进行了资源调查，而有关珊瑚菌遗传多样性结构状况研究尚未开展。在众多分子生物学遗传多样性研究方法中，AFLP分子标记技术具有实验操作简单、快速、高效、遗传多态性高、重复性好等特点，其检测遗传位点效率高于ISSR和SSR等技术。通过AFLP位点遗传多样性分析，可以检测居群的遗传多样性水平；通过遗传多样度、基因多样度各指数的分析可以了解居群的遗传结构和遗传分化；分析群体间的遗传相似性和遗传距离；通过聚类分析获得显示各居群间亲缘关系的进化系统。本研究运用AFLP分子标记技术在分子水平上探讨吉林市左家地区18株的珊瑚菌亲缘关系和遗传多样性，旨在揭示珊瑚菌遗传多样性水平，遗传结构及其遗传分化，为珊瑚菌这一重要食（药）用资源保护与利用奠定理论基础。
1材料与方法
1.1试验材料
从吉林市左家镇三个地区采集18株野生珊瑚菌子实体（三个居群，分别编号为LT1-6，FM1-6和ZJ1-6），样品采集后用硅胶干燥并置于密封袋中。
1.2主要试剂
AFLP接头、预扩增引物和选择性扩增引物由上海生工公司合成；Ex Taq DNA聚合酶、dNTP和DNA ladder Mix购自Takara公司。
1.3珊瑚菌总DNA 的提取
称量珊瑚菌子实体干燥样品0.2克，采用改良的CTAB法[7]提取珊瑚菌基因组DNA，加100μL的TE缓冲液溶解总DNA，-20℃冻存备用。
1.4 AFLP扩增
1.4.1 酶切与接头连接 酶切反应体系为1×T4 ligation buffer，1U EcoRI，1U MseI，100μmol/L EcoRI接头，100μmol/L MseI 接头，1U T4 ligase，200ng基因组DNA，加水补足到总反应体积为30μL。混匀反应体系，在37℃条件下酶切4 小时，继续在16℃条件下连接8 小时后4℃保存。
1.4.2预扩增和选择性扩增 本文所用的预扩增引物和荧光标记的选择性扩增引物由Invitrogen公司合成。预扩增反应体系为25μL，包括1×反应缓冲液，300μmol/L dNTPs，350μmol/L引物，0.5U ExTaq DNA聚合酶，1μL基因组DNA酶切产物作为模板。PCR反应条件为95 ℃预变性5分钟，94℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸90秒，35次循环，72℃延伸10min，4℃保存。预扩增PCR反应产物稀释20倍作为选择性扩增PCR的模板。选择性扩增反应体系为25μL，包括1×反应缓冲液，300μmol/L dNTPs，350μmol/L引物，0.5U ExTaq DNA聚合酶，1μL稀释好的预扩增产物作为模板。PCR反应条件为95 ℃预变性5分钟，94℃变性45秒，65℃退火45秒，72℃延伸90秒，10次循环，每轮循环温度递减1℃，94℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸90秒，35次循环，72℃延伸10分钟，4℃保存。反应产物在1.2%琼脂糖凝胶中电泳 80 V电压下电泳60 分钟，用凝胶成像系统观察照相。
1.4.3AFLP选择性扩增结果的检测与分析 AFLP选择性扩增产物送交长春华大中天生物技术有限公司进行毛细管电泳和荧光信号读取。进行统计AFLP扩增条带时，荧光信号值大于80时认为有条带记录为1，小于80时认为没有条带记录为0。应用NTSYS-pc2.1软件计算样品之间的相似系数，并进行UPGMA聚类分析。根据遗传距离用Mega3.0软件UPGMA法聚类分析构建系统树。
2结果与分析
2.1珊瑚菌的遗传距离和相似系数分析
通过一共从36对选择性扩增的引物组合中读取3227条带，其中多态性条带有2758条（占85.4%）。遗传距离（Genetic Distance）和相似系数（Genetic Identity）是用来衡量种群之间遗传分化程度的重要指标用POPGENE 32软件对吉林市左家镇18株珊瑚菌（3个取样地点）进行遗传距离和相似系数分析，结果见表1。
3个珊瑚菌群间的遗传距离的变化范围在0.223～0.712之间，相似系数的变化范围在0.442～0.824之间。珊瑚菌居群 ZJ与居群FM之间的遗传距离最小，为0.223 相似系数也是最高的为0.824。左家地区珊瑚菌居群 ZJ与居群LT之间的遗传距离最大，为0.712，同样相似系数是最低的，为0.442。 2.2珊瑚菌样品间和居群间的亲缘关系聚类分析
用软件NTSYS-pc 2.1对18个试验样品相似系数进行分析，使用UPGMA法进行聚类分析，结果见图1。
图1表明ZJ-3号和ZJ-5号样品的相似性最大，相似系数为0.79，说明这2个样品的亲缘关系最为接近。聚类图在相似系数约为0.50处可划分为三大组，第1组包括9份资源，组内又可划分2个亚组。第2组包括4份资源。其他分散的样品为LT居群的5份资源，相互之间遗传差异较大。上述结果表明左家地区居群（ZJ）和居群（FM）的亲缘关系近，而居群（LT）与前两者亲缘关系较远。
3结语
随着人们对食用珊瑚菌兴趣的增加，野生珊瑚菌资源受到了巨大的威胁。吉林市左家地区具有丰富的野生珊瑚菌资源，为了了解野生珊瑚菌遗传多样性，避免野生珊瑚菌遗传多样性的散失，本文通过分析左家镇3个地点的18株野生珊瑚菌样品的遗传多样性水平，发现左家珊瑚菌具有较高的遗传多样性，AFLP多态位点百分率为85.4%，高于羊肚菌（79.55%）、松茸（76.92%）和冬虫夏草（69.60%），而低于美味牛肝菌（93.34%）[10]。而野生珊瑚菌遗传相似性的UPGMA聚类图（图1）以及遗传距离和遗传相似性分析（表1）表明左家镇ZJ居群野生珊瑚菌的遗传多样性远高于LT居群和FM居群。这一现象可能表明左家镇的ZJ居群的野生珊瑚菌资源保护较好，而LT居群和FM居群的野生珊瑚菌资源可能因为人类活动已经遭到了一定程度的破坏。
参考文献
[1]常正尧，吴亚楠，李永芳，郭淼，赵静，刘京昇，李效良，齐冰. 珊瑚菌抗乳腺癌作用的研究[J]. 时珍国医国药，2013，（01）：152-154.
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[4]李仲贤. 秦巴山区野生珍稀珊瑚菌分离培养研究[J]. 陕西农业科学，2013，（03）：54-55.
[5]苏鸿雁，杨晓霞. 鸡足山珊瑚菌资源调查[J].大理学院学报，2002，（04）：49-50.
[6]穆慧敏，姜华，王艳丽，孙国昌. 研究稻瘟病菌群体遗传多态性的分子标记方法[J]. 中国水稻科学，2013，（05）：545-552.
[7]Saghai-Maroof MA， Soliman， KM Jorgensen RA， et al. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley： Mendelian inheritance， chromosomal location， and population dynamics[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1984， 81（24）：8014-8018.
[8]Yeh FC， Boyle TJB. Population genetic analysis of co-dom
inant and dominant markers and quantitive trait[J]. Belgian Journal of Botany， 1997 （1） ： 129-157.
[9]Kumar S， Tamura K， Nei M. MEGA3： Integrated software for molecular evolutionary genetic analysis and sequence alignment[J]. Briefings in Bioinformatics， 2004， 5 （2） ： 150-163
[10] 刘文丛， 张建博， 桂明英等. 滇西北地区5种羊肚菌遗传多样性的ISSR分析[J]. 中国食用菌， 2011，30（4）： 38-42.
[11] 李华，卫敏，陈俙妍，刘钟栋，梁永波. 珊瑚菌总萜提取工艺研究[J]. 时珍国医国药，2012，（04）：950-951.
[12] 易千红，叶佳明，鲁晓航，何荣军. 珊瑚菌液体发酵条件优化及其胞内多糖的组成研究[J].发酵科技通讯，2013，（02）：18-21.
[13] 郑永标，何佳，吴雅滨，许小萍，庞海月. 珊瑚菌液体发酵工艺优化及其菌丝体的化学成分分析[J]. 食用菌， 2015（06）：7-9.
[14] 王丽娟，张飞，苗玉洁. 珊瑚菌多糖的提取及其对羟自由基的清除作用研究[J]. 食品工业，2012（10）：43-46.
[15] 刘文丛， 张建博， 桂明英，等. 滇西北地区5种羊肚菌遗传多样性的ISSR分析[J]. 中国食用菌， 2011，30（04）：38-42.
作者简介：王凤兰，吉林农业科技学院，本科在读，研究方向：生物工程。
通讯作者：于晓明，硕士，吉林农业科技学院，讲师，研究方向：分子生物学与基因工程。