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摘要：用CTAB法提取3个番茄品种及6份品种亲本材料的DNA，通过AFLP-PCR分子标记方法，构建亲本及品种的指纹图谱。其结果利用如下：从分子水平构建了3个品种及其6份亲本材料的指纹图谱，6份亲本材料扩增的多态性条带从10～27条不等，平均17.56条，多态性位点比率为41.3％。通过符合率测定，亲本纯度符合率为100％，杂种一代为98.7％。利用Nei＆Li法计算番茄遗传相似系数，3个品种及亲本的遗传相似系数分别于0.37～0.61和0.53～0.62，采用UPGMA法进行聚类分析，对3个番茄品种及其亲本的遗传关系进行分析，为番茄杂交育种提供理论参考。
关键词：番茄品种；指纹图谱：构建
番茄是世界重要的蔬菜作物之一。其品种较为繁杂。不同番茄品种区分较为困难，传统的方法是通过表型特征判断，耗时耗力。后来发展起来的通过同工酶和种子蛋白电泳技术进行鉴别，都存在或是受环境或是受发育阶段等方面影响较大的缺点，而通过DNA指纹技术鉴定种子的真实性和纯度基本不存在这方面的影响，因此通过DNA指纹技术建立品种和品系的指纹图谱来保护品种和品系的真实性和纯度较为准确，并具有重要的实际意义。本研究通过AFLP指纹技术建立了东农番茄3个品种及其亲本品系的指纹图谱，分析了各自的遗传相似系数和树状图，为培育出更多更好的番茄杂交品种打下了良好的基础，为番茄的品种区分及纯度鉴定，提供了重要的理论依据，同时为种子繁育及销售作了良好的铺垫。
1 材料与方法
1.1材料
试验于2009年在东北农业大学番茄研究所进行，选取3个东农番茄品种及其亲本，分别取其幼叶现取现用。供试品种及其亲本来源见表1、表2。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取采用稍加改进的CTAB法。取0.2 g嫩叶放入1.5 mL的Eppendort管，液氮研磨，加入CTAB提取液，混匀后放人65℃水浴锅中1h，期间不断上下翻动，然后取出静止10min；13000r·h-1离心10 min，取上清液转移到另1个干净Eppendort管中，加入等体积氯仿异戊醇(24：1)抽提2次。混匀后置于－20℃冰箱内20 min：取出后13000 r·h-1。离心10 min，倒掉上清液，沉淀DNA用80％酒精清洗2次，无菌条件下吹干，加300uL去离子水和4ul RNA酶，37℃水浴1h，取出加300 uL去离子水、600 uL氯仿异戊醇，混匀后静止10min；13 000 r·h1离心10 min，取上清液400 uL加入80 uL NaAc，摇匀，再加1 mL乙醇，在-20℃条件下保存20 min；取出后12 500 r·h1离心10 min，倒掉上清液，用80％酒精洗2次，无菌条件下吹干，加入30uL去离子水溶解后于－20℃保存。提取的DNA质量通过分光光度计和1％琼脂糖电泳检测。
1.2.2 AFLP分析采用本实验室所用的20对AFLP引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，如表3所示。
基因组DNA的双酶切和连头连接采用一步完成。其反应体系为：模板DNA 150 ng；EcoR I(10U·uL-1)取0.5uL；Mse I(IOU·uL-1)取0.5 txL；EcoR I adapter(5 pmol·uL-1)取1.0uL；Mse I adapter(50pmoL·uL-1)取1.0 uL；ATP(10 mmol·L-1)取1.0 ixL；10xBuffer取5.0 IxL；T4 DNA Ligase(5 U·uL-1)取0.6uL；ddH20定容至50uL。37℃酶切与连接10 h。
预扩增体系：DNA(酶切连接后产物)取2uL，EcoR I-primer(E00 50 ng·uL-1)取0.6 uL，Mse I—primer(MOO 50 ng·uL-1)取0.6uL，10xBuffer取2uL，dNTP(2.5 mmol·L-1)取1.6 uL；MgCL2取1.2uL，Taq DNA polymerase(5 U·uL-1)取0.2uL ddH2O定容至20uL。
1.4 纯度鉴定方法
通过人工育苗，选取品种及亲本每份材料壮苗各120株，在2叶1心时提取DNA做AFLP分析，调查种子纯度。苗期于田间随机抽查6份亲本材料各100株，3份杂交一代各100株，加以标记，室内提取叶片DNA做AFLP分析，并与田间调查结合作出结论。
2 结果与分析
2.1 6份亲本材料的AFLP多样性检测
随机选取20对AFLP引物，分别对6份材料的DNA进行AFLP-PCR分析，筛选出了9对扩增产物多态性好、谱带清晰的AFLP引物，其引物组合如表4。利用筛选出的9对引物对表1中的6份亲本材料的基因组DNA进行了AFLP分析。6份材料共扩增出383条带。其中158条带具有多态性，总平均多态性比率达41.3％：每对引物组合平均检出多态性条带为17.56条，多态性比率在22.2％-63.0％。
2.2 3个番茄品种及其亲本AFLP遗传相似系数
利用NTSYS2.1la分析软件，采用简单匹配系数计算3个品种及其亲本品系的遗传距离相似系数，如表5、表6所示。表中数据采用的是Nei-Li系数的SM方法计算出的遗传相似系数，可知6份亲本材料的遗传相似系数在0.37-0.61，遗传背景比较狭窄，说明品种亲本之间有比较近的亲缘关系，这对于培育优质番茄品种不是很有利。3份品种材料的遗传相似系数在0.53-0.62，平均遗传相似系数为0.56。品种亲本的遗传相似系数平均为0.52，而品种为0.56，基本一致，其差异之处可能有2种原因：一是不同品种亲本之间表现出差异性，而品种之间并无差异性：二是亲本遗传时由于某些原因造成了一些位点的缺失，使得品种间存在差异，具体原因需要进一步研究确定。
2.3 3个番茄品种及其亲本AFLP聚类图
采用非加权配对算术平均数法对番茄3个品种亲本品系及品种做聚类分析，建立聚类树状图(图1、图2)。由聚类分析结果可以看出，在相似系数0.57处，6份亲本材料被划分为2个类群和1个特殊类群：第1类包括3个，即07925、0912F和T512；第2类包括2个，即0912M和T511：还有1个特殊类群08576。在相似系数0.60处，3份品种材料被划分为2个类群，712和713聚为1类，708单独成为1类。
3 讨论
栾雨时等嘲用放射性同位素Y-32P-ATP标记人工合成的简单重复序列(GATA)。与经Dra I酶切的8个番茄品种的DNA进行Southern杂交，用SSR方法得到了DNA指纹在品种间差异很大，在品种内单株间无差异的结论。在本研究中，曾经用SSR方法扩增出的材料条带之间无太大的区别，这可能有两方面的原因，一方面实验中所采用利用SSR引物直接进行材料DNA扩增：另一方面是番茄品种为栽培品种或者亲缘关系较近，有待于进一步验证。宋健等m利用SSR分子标记分析番茄的遗传多样性，得出野生番茄亲缘关系较远，栽培番茄亲缘关系较近的结论。本研究中，亲本的遗传相似系数在0.37～0.61，品种的在0.53-0.62，遗传相似系数比较近，由于品种及品种亲本均为栽培种，这与宋健等人所得的结论是一致的。
孙德岭等用AFLP标记了白菜类蔬菜，通过聚类分析证明了AFLP技术用于白菜类蔬菜亲缘关系鉴定的可行性。本实验首次采用AFLP方法标记了番茄品种及其亲本，建立了指纹图谱，通过指纹图谱发现亲本及其品种扩增后的条带基本一致，再者通过聚类分析发现品种712和713聚在一起，而两者的亲本也是交叉聚在一起，708单独列为1类，其2个亲本也是单独成类，亲本和品种的聚类结果是一致的。可见，采用AFLP方法构建番茄品种指纹图谱是可行的。
明军利用AFLP分子标记方法对梅花一些主要品种进行了指纹图谱的构建，贾晓燕㈣用SSR和AFLP方法构建了河北省大豆一些推广品种的指纹图谱，并对其遗传多样性进行了分析，但这些利用分子标记构建指纹图谱的研究基本上都停留在单独对品种或是单独对品系的构建上。本研究同时构建了品种和其亲本各自的指纹图谱，这对于保护品种、品种来源及各自的纯度有很重要的意义，并且为番茄杂交育种亲本的选配提供了理论依据，可更好的指导番茄杂交育种研究。
4 结论
从20对AFLP引物中筛选到9对重复性好、多态性丰富的AFLP引物，利用这9对引物组合可以准确鉴别3个品种及6份品种亲本材料。建立了9份材料的DNA指纹图谱。同时根据指纹图谱分析了材料的遗传相似系数，亲本在0.37-0.61，品种在0.53-0.62。通过聚类图分析了亲本的遗传关系，这些结论的得出为番茄的品种区分及纯度鉴定，提供了重要的理论依据，同时为种子繁育及销售作了良好的铺垫。
关键词：番茄品种；指纹图谱：构建
番茄是世界重要的蔬菜作物之一。其品种较为繁杂。不同番茄品种区分较为困难，传统的方法是通过表型特征判断，耗时耗力。后来发展起来的通过同工酶和种子蛋白电泳技术进行鉴别，都存在或是受环境或是受发育阶段等方面影响较大的缺点，而通过DNA指纹技术鉴定种子的真实性和纯度基本不存在这方面的影响，因此通过DNA指纹技术建立品种和品系的指纹图谱来保护品种和品系的真实性和纯度较为准确，并具有重要的实际意义。本研究通过AFLP指纹技术建立了东农番茄3个品种及其亲本品系的指纹图谱，分析了各自的遗传相似系数和树状图，为培育出更多更好的番茄杂交品种打下了良好的基础，为番茄的品种区分及纯度鉴定，提供了重要的理论依据，同时为种子繁育及销售作了良好的铺垫。
1 材料与方法
1.1材料
试验于2009年在东北农业大学番茄研究所进行，选取3个东农番茄品种及其亲本，分别取其幼叶现取现用。供试品种及其亲本来源见表1、表2。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取采用稍加改进的CTAB法。取0.2 g嫩叶放入1.5 mL的Eppendort管，液氮研磨，加入CTAB提取液，混匀后放人65℃水浴锅中1h，期间不断上下翻动，然后取出静止10min；13000r·h-1离心10 min，取上清液转移到另1个干净Eppendort管中，加入等体积氯仿异戊醇(24：1)抽提2次。混匀后置于－20℃冰箱内20 min：取出后13000 r·h-1。离心10 min，倒掉上清液，沉淀DNA用80％酒精清洗2次，无菌条件下吹干，加300uL去离子水和4ul RNA酶，37℃水浴1h，取出加300 uL去离子水、600 uL氯仿异戊醇，混匀后静止10min；13 000 r·h1离心10 min，取上清液400 uL加入80 uL NaAc，摇匀，再加1 mL乙醇，在-20℃条件下保存20 min；取出后12 500 r·h1离心10 min，倒掉上清液，用80％酒精洗2次，无菌条件下吹干，加入30uL去离子水溶解后于－20℃保存。提取的DNA质量通过分光光度计和1％琼脂糖电泳检测。
1.2.2 AFLP分析采用本实验室所用的20对AFLP引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，如表3所示。
基因组DNA的双酶切和连头连接采用一步完成。其反应体系为：模板DNA 150 ng；EcoR I(10U·uL-1)取0.5uL；Mse I(IOU·uL-1)取0.5 txL；EcoR I adapter(5 pmol·uL-1)取1.0uL；Mse I adapter(50pmoL·uL-1)取1.0 uL；ATP(10 mmol·L-1)取1.0 ixL；10xBuffer取5.0 IxL；T4 DNA Ligase(5 U·uL-1)取0.6uL；ddH20定容至50uL。37℃酶切与连接10 h。
预扩增体系：DNA(酶切连接后产物)取2uL，EcoR I-primer(E00 50 ng·uL-1)取0.6 uL，Mse I—primer(MOO 50 ng·uL-1)取0.6uL，10xBuffer取2uL，dNTP(2.5 mmol·L-1)取1.6 uL；MgCL2取1.2uL，Taq DNA polymerase(5 U·uL-1)取0.2uL ddH2O定容至20uL。
1.4 纯度鉴定方法
通过人工育苗，选取品种及亲本每份材料壮苗各120株，在2叶1心时提取DNA做AFLP分析，调查种子纯度。苗期于田间随机抽查6份亲本材料各100株，3份杂交一代各100株，加以标记，室内提取叶片DNA做AFLP分析，并与田间调查结合作出结论。
2 结果与分析
2.1 6份亲本材料的AFLP多样性检测
随机选取20对AFLP引物，分别对6份材料的DNA进行AFLP-PCR分析，筛选出了9对扩增产物多态性好、谱带清晰的AFLP引物，其引物组合如表4。利用筛选出的9对引物对表1中的6份亲本材料的基因组DNA进行了AFLP分析。6份材料共扩增出383条带。其中158条带具有多态性，总平均多态性比率达41.3％：每对引物组合平均检出多态性条带为17.56条，多态性比率在22.2％-63.0％。
2.2 3个番茄品种及其亲本AFLP遗传相似系数
利用NTSYS2.1la分析软件，采用简单匹配系数计算3个品种及其亲本品系的遗传距离相似系数，如表5、表6所示。表中数据采用的是Nei-Li系数的SM方法计算出的遗传相似系数，可知6份亲本材料的遗传相似系数在0.37-0.61，遗传背景比较狭窄，说明品种亲本之间有比较近的亲缘关系，这对于培育优质番茄品种不是很有利。3份品种材料的遗传相似系数在0.53-0.62，平均遗传相似系数为0.56。品种亲本的遗传相似系数平均为0.52，而品种为0.56，基本一致，其差异之处可能有2种原因：一是不同品种亲本之间表现出差异性，而品种之间并无差异性：二是亲本遗传时由于某些原因造成了一些位点的缺失，使得品种间存在差异，具体原因需要进一步研究确定。
2.3 3个番茄品种及其亲本AFLP聚类图
采用非加权配对算术平均数法对番茄3个品种亲本品系及品种做聚类分析，建立聚类树状图(图1、图2)。由聚类分析结果可以看出，在相似系数0.57处，6份亲本材料被划分为2个类群和1个特殊类群：第1类包括3个，即07925、0912F和T512；第2类包括2个，即0912M和T511：还有1个特殊类群08576。在相似系数0.60处，3份品种材料被划分为2个类群，712和713聚为1类，708单独成为1类。
3 讨论
栾雨时等嘲用放射性同位素Y-32P-ATP标记人工合成的简单重复序列(GATA)。与经Dra I酶切的8个番茄品种的DNA进行Southern杂交，用SSR方法得到了DNA指纹在品种间差异很大，在品种内单株间无差异的结论。在本研究中，曾经用SSR方法扩增出的材料条带之间无太大的区别，这可能有两方面的原因，一方面实验中所采用利用SSR引物直接进行材料DNA扩增：另一方面是番茄品种为栽培品种或者亲缘关系较近，有待于进一步验证。宋健等m利用SSR分子标记分析番茄的遗传多样性，得出野生番茄亲缘关系较远，栽培番茄亲缘关系较近的结论。本研究中，亲本的遗传相似系数在0.37～0.61，品种的在0.53-0.62，遗传相似系数比较近，由于品种及品种亲本均为栽培种，这与宋健等人所得的结论是一致的。
孙德岭等用AFLP标记了白菜类蔬菜，通过聚类分析证明了AFLP技术用于白菜类蔬菜亲缘关系鉴定的可行性。本实验首次采用AFLP方法标记了番茄品种及其亲本，建立了指纹图谱，通过指纹图谱发现亲本及其品种扩增后的条带基本一致，再者通过聚类分析发现品种712和713聚在一起，而两者的亲本也是交叉聚在一起，708单独列为1类，其2个亲本也是单独成类，亲本和品种的聚类结果是一致的。可见，采用AFLP方法构建番茄品种指纹图谱是可行的。
明军利用AFLP分子标记方法对梅花一些主要品种进行了指纹图谱的构建，贾晓燕㈣用SSR和AFLP方法构建了河北省大豆一些推广品种的指纹图谱，并对其遗传多样性进行了分析，但这些利用分子标记构建指纹图谱的研究基本上都停留在单独对品种或是单独对品系的构建上。本研究同时构建了品种和其亲本各自的指纹图谱，这对于保护品种、品种来源及各自的纯度有很重要的意义，并且为番茄杂交育种亲本的选配提供了理论依据，可更好的指导番茄杂交育种研究。
4 结论
从20对AFLP引物中筛选到9对重复性好、多态性丰富的AFLP引物，利用这9对引物组合可以准确鉴别3个品种及6份品种亲本材料。建立了9份材料的DNA指纹图谱。同时根据指纹图谱分析了材料的遗传相似系数，亲本在0.37-0.61，品种在0.53-0.62。通过聚类图分析了亲本的遗传关系，这些结论的得出为番茄的品种区分及纯度鉴定，提供了重要的理论依据，同时为种子繁育及销售作了良好的铺垫。