论文部分内容阅读
摘要：目的 觀察止嗽散加减方对慢性阻塞性肺疾病（COPD）寒燥模型大鼠表皮生长因子受体（EGFR）及中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）的影响。方法 利用气管滴注弹性蛋白酶结合烟熏90 d建立COPD模型，在此基础上予以寒燥应激90 d建立COPD寒燥模型。将COPD寒燥模型大鼠随机分为寒燥组和中药组，中药组连续干预7 d。第97日处死大鼠，观察其肺组织病理形态。RT-qPCR和Western blot分别检测肺组织EGFR mRNA和蛋白表达，ELISA检测血清和肺泡灌洗液NE含量。结果 COPD组、寒燥组、中药组肺组织EGFR mRNA和蛋白表达较对照组均升高，中药组肺组织EGFR蛋白表达较COPD组和寒燥组均降低；COPD组、寒燥组和中药组血清和肺泡灌洗液NE含量较对照组升高，寒燥组肺泡灌洗液NE含量高于COPD组，中药组肺泡灌洗液NE含量低于寒燥组。结论 止嗽散加减方可能通过降低寒燥COPD模型大鼠肺组织EGFR和NE的水平，达到治疗COPD的目的。
关键词：慢性阻塞性肺疾病；寒燥；止嗽散加减方；表皮生长因子受体；中性粒细胞弹性蛋白酶
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.10.013
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）10-0053-04
Effects of Modified Zhisou Power on Epidermal Growth Factor Receptor and Neutrophil Elastase in Rats with Cold-Dryness Chronic Obstructive Pulmonary Disease GAO Zhen， WANG Jing， JIANG Min， LI Zheng， XU Dan， Halmurat UPUR， JING Jing， LI Feng-sen （National Clinical Research Base of Traditional Chinese Medicine， Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University， Urumqi 830000， China）
Abstract： Objective To reveal the effects of cold-dryness and modified Zhisou Power on epidermal growth factor receptor （EGFR） and neutrophil elastase （NE） in rats with COPD. Methods COPD model was established with an elastase dose into the trachea combined with exposure to smoking for 90 d； cold-dryness COPD group was further developed by exposure to a cold， dry environment for 90 d. After 90 days， cold-dryness COPD rats was divided into cold-dryness group and Zhisou Power intervention group （treated with modified Zhisou Power for 7 days）. On the 97th day， all rats were killed. Pathological changes in lungs were observed. mRNA and protein expression of EGFR were measured by RT-qPCR and Western blot， and the amount of NE in serum and BALF were examined by ELISA. Results EGFR mRNA and protein expression were significantly higher in COPD group， cold-dryness group and Zhisou Power intervention group than in control group. EGFR was significantly lower in Zhisou Power intervention group than in COPD group and cold-dryness group. NE was significantly higher in serum and BALF in COPD group， cold-dryness group and Zhisou Power intervention group than in control group. NE in BALF was significantly higher in cold-dryness group than in COPD group. NE in BALF was significantly lower in Zhisou Power intervention group than in cold-dryness group. Conclusion Modified Zhisou Power can down-regulate the expression of EGFR and the mount of NE in cold-dryness COPD rats to treat COPD. Key words： COPD； cold-dryness； modified Zhisou Power； epithelial growth factor receptor； neutrophil elastase
新疆地处中国西北部，为世界上离海洋最远的地
基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金（2015211C138）
通讯作者：李风森，E-mail：fengsen602@163.com
区，气候干燥寒冷。新疆慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）在中医证型、证素、症状等中医特点上与内地有别，表现出寒、燥的临床特点[1]。流行病学调查显示，西北寒燥证是新疆COPD的特殊和多发证型之一[2]。前期研究发现，寒燥可以降低COPD模型大鼠肺组织水通道蛋白（aquaporin，AQP）4和AQP5表达，升高黏蛋白（mucin，MUC）5AC和MUC5B表达[3]。本研究拟在前期研究的基础上，观察中药止嗽散加减方对COPD寒燥模型大鼠表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）及中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）的影响，初步探讨其可能的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
清洁级雄性Wistar大鼠65只，5周龄，体质量（150±20）g，新疆医科大学实验动物中心，动物许可证号SCXK（新）2003-0001。饲养于新疆医科大学SPF级实验动物中心，温度（25±3）℃、相对湿度60%～80%。
1.2 药物及制备
止嗽散加减方由《医学心悟》中止嗽散化裁而成，由荆芥10 g、陈皮10 g、炙甘草10 g、桔梗10 g、百部30 g、紫菀20 g、款冬花20 g、紫苏叶10 g、苦杏仁15 g、生姜10 g、川贝母9 g组成，上述饮片购自新疆医科大学附属中医医院药学部，水煎2次，蒸发去液体后低温烘干制成粉状浸膏，7剂中药计1078 g原药材，共制得粉状浸膏370 g，低温干燥保存待用。
1.3 主要试剂与仪器
PCR、Western blot ELISA试剂盒（美国Santa Cruz Biotechnology），弹性蛋白酶（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。FLI-2000H型人工气候箱（日本EYELA公司），BUXCO MA1320呼吸功能实验平台（美国Buxco公司），BS-1105型电子天平（北京赛多克斯天平有限公司），DM600B-1显微镜（德国Leica公司），JEM-1230型生物用透射电子显微镜（日本电子株式会社），亚克力染毒箱（自制），哈德门牌卷烟（山东中烟工业有限责任公司）。
2 实验方法
2.1 分组、造模和给药
实验大鼠采用随机数字表法分为COPD寒燥组30只、COPD组20只、对照组15只。实验参照文献[4]制作COPD模型。于实验开始后第30日按每100 g体质量气管滴注溶于0.8 mL生理盐水20 U NE；第1～29日、31～97日每日进行烟熏。在规定时间每日置于亚克力染毒箱内，染毒箱连接吸烟装置，用三通管及80 mL喂食器将卷烟抽吸后注入染毒箱内，以15吸/min随时补充烟雾，保持烟雾浓度相对稳定，每次18只大鼠吸烟1 h。在2组动物吸烟中间清洁染毒箱，打开入口及排气口，风扇鼓风通气5 min驱散残存烟雾。参照文献[5]方法制作COPD寒燥模型。在给予COPD模型施加因素的基础上叠加以下处理因素：第1～97日每晚将大鼠置于系统设置为温度（6±2）℃、湿度25%～32.8%的人工气候箱，每日10 h。对照组正常环境中常规饲料喂养，第30日大鼠与模型组相同术式气管滴注等体积生理盐水。所有大鼠饲养97 d，第90日时将COPD寒燥模型大鼠随机分为中药组和寒燥组，中药组给予止嗽散加减方灌胃，给药剂量根据人体内服剂量按人和动物间体表面积折算的等效剂量进行换算，每只大鼠予浸膏0.96 g溶于10 mL水，每次5 mL，早晚各1次，COPD组、寒燥组给予等量生理盐水灌胃，连续7 d。
2.2 肺组织病理观察
第97日大鼠戊巴比妥钠麻醉，下腔静脉抽血处死，迅速摘取大鼠肺组织，取右肺中叶，部分气管、支气管，10%福尔马林固定，常规脱水、浸蜡包埋、切片（2 μm），每块组织连续切片3张，HE染色，光学显微镜下观察组织形态学改变。
2.3 实时荧光定量PCR检测
RT-qPCR检测肺组织EGFR mRNA水平。EGFR引物序列：上游TGCCCACCACTCATGCTGTA，下游GCCGTGATCTGTCACCACGTA，產物长度153 bp。采用2步法：95 ℃、30 s，95 ℃、5 min，56 ℃、30 s，40个循环。以β-actin Ct值标化EGFR Ct值，采用2-ΔΔCt方法计算EGFR mRNA表达。
2.4 Western blot检测
取大鼠肺组织，加适量RIPA裂解缓冲液，提取组织总蛋白。BSA法定量蛋白浓度后，取蛋白样品20 μg经120 g/L SDS-PAGE胶电泳分离，120 V条件下电泳约1 h，将胶从电泳槽取出，在转移缓冲液中恒压100 V下转膜2 h。50 g/L脱脂奶粉TBST室温封存1 h，EGFR大鼠单克隆抗体（EGFR 1∶200，羊抗鼠）4 ℃过夜孵育，抗羊IgG二抗（1∶1000）室温孵育1 h，ECL发光剂显影，Bio-Rad软件对条带进行灰度扫描分析，以β-actin作为内参，计算EGFR相对表达量。
2.5 中性粒细胞弹性蛋白酶含量检测
切开分离下腔静脉，抽取静脉血5 mL，5 ℃、2500 r/min离心15 min，吸取血清，置于-70 ℃冰箱保存待测。随后，按以下方法收集支气管肺泡灌洗液：经下腔静脉抽血处死大鼠，将气管与双肺暴露，做气管下部横行切口，对右主支气管予以结扎，用接12号针头（尖端磨平）的注射器经气管切口向左肺缓慢灌注无菌生理盐水3 mL，每次灌注后立即回收灌注液，纱布过滤，重复3次。BALF离心，取其上清液移入无菌瓶内，置于-70 ℃超低温冰箱保存待测。ELISA用于定量检测大鼠血清及肺泡灌洗液中NE的浓度，操作严格按照试剂盒说明书进行。 3 统计学方法
采用SPSS11.5统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，凡符合正态分布和方差齐的数据采用方差分析，多组间两两比较采用LSD法，若方差不齐则用Tamhane方法进行两两比较。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 肺组织病理观察结果
对照组肺泡大小基本一致，肺泡壁厚度正常，外周未见炎性细胞浸润，或见极少量炎症细胞散在分布；COPD组见大量炎症细胞浸润，肉芽肿发生；寒燥组见大量炎性浸润，肉芽肿发生，部分肺纤维化；中药组见炎性浸润发生，较COPD组和寒燥组部分改善。结果见图1。
4.2 止嗽散加减方对模型大鼠肺组织表皮生长因子受体mRNA和蛋白表达的影响
与对照组比较，COPD组、寒燥组、中药组大鼠肺组织EGFR mRNA和蛋白表达明显升高（P<0.01）；中药组EGFR mRNA表达较寒燥组有下降趋势，但差异无统计学意义；中药组肺组织EGFR蛋白表达较COPD组和寒燥组明显降低（P<0.01）。结果见表1、图2。
4.3 止嗽散加减方对模型大鼠肺组织血清和肺泡灌洗液中性粒细胞弹性蛋白酶含量的影响
与对照组比较，寒燥组血清NE含量明显升高（P<0.01），中药组血清NE含量明显升高（P<0.05）；COPD组肺泡灌洗液NE含量明显升高（P<0.05），寒燥组肺泡灌洗液NE含量明显升高（P<0.01），中药组肺泡灌洗液NE含量明显升高（P<0.05）；与COPD组比较，寒燥组肺泡灌洗液NE含量明显升高（P<0.05）；与寒燥组比较，中药组肺泡灌洗液NE含量明显降低（P<0.01）。结果见表2。
5 讨论
《寓意草·与门人定议病式》把“辨高卑燥湿，五方异宜”作为“议病式”的重要内容之一；《注解伤寒论·伤寒例》更进一步明确“医之治病，当审其土地所宜”。新疆处于中国西北地区，地势高而寒冷少雨，其病多燥寒。寒燥与津液的关系密切，一方面影响津液的量，另一方面影响津液的功效，而中医的津液表现在气道则与黏液的功能相近[6]。
前期实验研究也发现，寒燥可促使COPD模型MUC5AC、MUC5B表达升高[3]。持续的气道黏液过度分泌及流变学特性的改变会导致黏液纤毛清除功能受损、丧失，使细菌定植成为可能，甚至发生炎性改变；还会导致小气道阻塞、气流受限、气体交换功能障碍，最终导致COPD进行性加重，甚至增加病死率，是影响病情及预后的独立危险因素。一系列因素可直接或间接作用于分泌细胞，致使MUC表达上调，分泌细胞过度化生，促使COPD患者气道黏液分泌量增加。其中NE是一种最大潜能的黏液促分泌剂[8]，在所有刺激黏液生成和分泌的因素中，75%的作用由NE发挥[8]。NE可同时诱导MUC5AC和MUC5B表达增高，且具有浓度依赖趋势[9]。NE不可逆转地改变了Clara细胞正常呈现的黏蛋白特征，导致产生异常的黏液[10]。而MUC5AC的合成受EGFR信号传递系统调节[11]，EGFR在COPD患者气道MUC的合成中发挥重要作用[12]。
本研究发现，COPD组、寒燥组和中药组模型大鼠肺部EGFR mRNA和蛋白表达均较对照组升高，寒燥对大鼠模型EGFR mRNA和蛋白表达的影响不大，而止嗽散加减方可降低COPD寒燥模型肺组织EGFR蛋白的表达。COPD组、寒燥组和中药组血清和肺泡灌洗液NE含量较对照组升高；同时，寒燥增加COPD模型大鼠肺泡灌洗液NE的含量，止嗽散加减方则可降低COPD寒燥模型大鼠肺泡灌洗液NE含量。
综上所述，本研究发现止嗽散加减方可降低COPD寒燥模型大鼠肺组织EGFR和NE的水平，这可能是该方理肺祛痰治疗COPD的机制之一。
参考文献：
[1] 高振，李风森，荆晶，等.新疆和内地慢性阻塞性肺疾病中医特点的对比研究[J].中华中医药杂志，2015，30（1）：195-198.
[2] 李风森，高振，荆晶，等.慢性阻塞性肺疾病西北寒燥证分布及临床特点[J].中国中医药信息杂志，2012，19（2）：22-24.
[3] GAO Z， UPUR H， WANG J， et al. Expression of airway mucus-associated proteins in rats with chronic obstructive pulmonary disease with a cold-dryness symptom pattern[J]. Journal of Traditional Chinese Medicine，2016，36（5）：671-677.
[4] GAO Z， LI F S， UPUR H， et al. Effect of cold-dryness on pulmonary and immunologic function in chronic obstructive pulmonary disease model rats[J]. J ournal of Traditional Chinese Mmedicine，2014， 34（2）：221-226.
[5] 高振，李风森，王晶，等.止嗽散加减方对慢性阻塞性肺疾病西北寒燥证大鼠模型肺功能的影响[J].中国中西医结合杂志，2014，34（5）：556-561.
[6] 王劍，徐志伟，严灿，等.从黏液类物质病理改变探讨痰证机理[J].上海中医药杂志，2007，30（6）：461-463.
[7] KISHIOKA K， OKAMOTO K， KIM J， et al. Regulation of secretion from mucous and serous cells in the excised ferret trachea[J]. Respir Physiol，2001，126（2）：163-171.
[8] 徐晓艳，周向东.中性粒细胞弹性蛋白酶与黏蛋白[J].中国药物与临床，2004，4（10）：741-744.
[9] 兰箭，孙航，刘杞，等.人中性粒细胞弹性蛋白酶诱导气道黏液高分泌细胞模型的建立及其机制的初步研究[J].中国生物工程杂志，2008， 28（3）：1-7.
[10] JAMIL S， BREUER R， CHRISTENSEN T G. Abnormal mucous cell phenotype induced by neutrophil elastase in hamster bronchi[J]. Exp Lung Res，1997，23（4）：285-295.
[11] TAKEYAMA K， DABBAGH K， LEE H M， et al. Epidermal growth factor system regulates mucin production in airways[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1999，96（6）：3081-3086.
[12] 毛翎，白春学，张敏，等.表皮生长因子受体和黏蛋白在慢性阻塞性肺疾病气道中的表达及意义[J].中华结核和呼吸杂志，2004，27（9）：585- 588.
（收稿日期：2017-02-14）
（修回日期：2017-03-07；编辑：华强）
关键词：慢性阻塞性肺疾病；寒燥；止嗽散加减方；表皮生长因子受体；中性粒细胞弹性蛋白酶
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.10.013
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）10-0053-04
Effects of Modified Zhisou Power on Epidermal Growth Factor Receptor and Neutrophil Elastase in Rats with Cold-Dryness Chronic Obstructive Pulmonary Disease GAO Zhen， WANG Jing， JIANG Min， LI Zheng， XU Dan， Halmurat UPUR， JING Jing， LI Feng-sen （National Clinical Research Base of Traditional Chinese Medicine， Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University， Urumqi 830000， China）
Abstract： Objective To reveal the effects of cold-dryness and modified Zhisou Power on epidermal growth factor receptor （EGFR） and neutrophil elastase （NE） in rats with COPD. Methods COPD model was established with an elastase dose into the trachea combined with exposure to smoking for 90 d； cold-dryness COPD group was further developed by exposure to a cold， dry environment for 90 d. After 90 days， cold-dryness COPD rats was divided into cold-dryness group and Zhisou Power intervention group （treated with modified Zhisou Power for 7 days）. On the 97th day， all rats were killed. Pathological changes in lungs were observed. mRNA and protein expression of EGFR were measured by RT-qPCR and Western blot， and the amount of NE in serum and BALF were examined by ELISA. Results EGFR mRNA and protein expression were significantly higher in COPD group， cold-dryness group and Zhisou Power intervention group than in control group. EGFR was significantly lower in Zhisou Power intervention group than in COPD group and cold-dryness group. NE was significantly higher in serum and BALF in COPD group， cold-dryness group and Zhisou Power intervention group than in control group. NE in BALF was significantly higher in cold-dryness group than in COPD group. NE in BALF was significantly lower in Zhisou Power intervention group than in cold-dryness group. Conclusion Modified Zhisou Power can down-regulate the expression of EGFR and the mount of NE in cold-dryness COPD rats to treat COPD. Key words： COPD； cold-dryness； modified Zhisou Power； epithelial growth factor receptor； neutrophil elastase
新疆地处中国西北部，为世界上离海洋最远的地
基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金（2015211C138）
通讯作者：李风森，E-mail：fengsen602@163.com
区，气候干燥寒冷。新疆慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）在中医证型、证素、症状等中医特点上与内地有别，表现出寒、燥的临床特点[1]。流行病学调查显示，西北寒燥证是新疆COPD的特殊和多发证型之一[2]。前期研究发现，寒燥可以降低COPD模型大鼠肺组织水通道蛋白（aquaporin，AQP）4和AQP5表达，升高黏蛋白（mucin，MUC）5AC和MUC5B表达[3]。本研究拟在前期研究的基础上，观察中药止嗽散加减方对COPD寒燥模型大鼠表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）及中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）的影响，初步探讨其可能的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
清洁级雄性Wistar大鼠65只，5周龄，体质量（150±20）g，新疆医科大学实验动物中心，动物许可证号SCXK（新）2003-0001。饲养于新疆医科大学SPF级实验动物中心，温度（25±3）℃、相对湿度60%～80%。
1.2 药物及制备
止嗽散加减方由《医学心悟》中止嗽散化裁而成，由荆芥10 g、陈皮10 g、炙甘草10 g、桔梗10 g、百部30 g、紫菀20 g、款冬花20 g、紫苏叶10 g、苦杏仁15 g、生姜10 g、川贝母9 g组成，上述饮片购自新疆医科大学附属中医医院药学部，水煎2次，蒸发去液体后低温烘干制成粉状浸膏，7剂中药计1078 g原药材，共制得粉状浸膏370 g，低温干燥保存待用。
1.3 主要试剂与仪器
PCR、Western blot ELISA试剂盒（美国Santa Cruz Biotechnology），弹性蛋白酶（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。FLI-2000H型人工气候箱（日本EYELA公司），BUXCO MA1320呼吸功能实验平台（美国Buxco公司），BS-1105型电子天平（北京赛多克斯天平有限公司），DM600B-1显微镜（德国Leica公司），JEM-1230型生物用透射电子显微镜（日本电子株式会社），亚克力染毒箱（自制），哈德门牌卷烟（山东中烟工业有限责任公司）。
2 实验方法
2.1 分组、造模和给药
实验大鼠采用随机数字表法分为COPD寒燥组30只、COPD组20只、对照组15只。实验参照文献[4]制作COPD模型。于实验开始后第30日按每100 g体质量气管滴注溶于0.8 mL生理盐水20 U NE；第1～29日、31～97日每日进行烟熏。在规定时间每日置于亚克力染毒箱内，染毒箱连接吸烟装置，用三通管及80 mL喂食器将卷烟抽吸后注入染毒箱内，以15吸/min随时补充烟雾，保持烟雾浓度相对稳定，每次18只大鼠吸烟1 h。在2组动物吸烟中间清洁染毒箱，打开入口及排气口，风扇鼓风通气5 min驱散残存烟雾。参照文献[5]方法制作COPD寒燥模型。在给予COPD模型施加因素的基础上叠加以下处理因素：第1～97日每晚将大鼠置于系统设置为温度（6±2）℃、湿度25%～32.8%的人工气候箱，每日10 h。对照组正常环境中常规饲料喂养，第30日大鼠与模型组相同术式气管滴注等体积生理盐水。所有大鼠饲养97 d，第90日时将COPD寒燥模型大鼠随机分为中药组和寒燥组，中药组给予止嗽散加减方灌胃，给药剂量根据人体内服剂量按人和动物间体表面积折算的等效剂量进行换算，每只大鼠予浸膏0.96 g溶于10 mL水，每次5 mL，早晚各1次，COPD组、寒燥组给予等量生理盐水灌胃，连续7 d。
2.2 肺组织病理观察
第97日大鼠戊巴比妥钠麻醉，下腔静脉抽血处死，迅速摘取大鼠肺组织，取右肺中叶，部分气管、支气管，10%福尔马林固定，常规脱水、浸蜡包埋、切片（2 μm），每块组织连续切片3张，HE染色，光学显微镜下观察组织形态学改变。
2.3 实时荧光定量PCR检测
RT-qPCR检测肺组织EGFR mRNA水平。EGFR引物序列：上游TGCCCACCACTCATGCTGTA，下游GCCGTGATCTGTCACCACGTA，產物长度153 bp。采用2步法：95 ℃、30 s，95 ℃、5 min，56 ℃、30 s，40个循环。以β-actin Ct值标化EGFR Ct值，采用2-ΔΔCt方法计算EGFR mRNA表达。
2.4 Western blot检测
取大鼠肺组织，加适量RIPA裂解缓冲液，提取组织总蛋白。BSA法定量蛋白浓度后，取蛋白样品20 μg经120 g/L SDS-PAGE胶电泳分离，120 V条件下电泳约1 h，将胶从电泳槽取出，在转移缓冲液中恒压100 V下转膜2 h。50 g/L脱脂奶粉TBST室温封存1 h，EGFR大鼠单克隆抗体（EGFR 1∶200，羊抗鼠）4 ℃过夜孵育，抗羊IgG二抗（1∶1000）室温孵育1 h，ECL发光剂显影，Bio-Rad软件对条带进行灰度扫描分析，以β-actin作为内参，计算EGFR相对表达量。
2.5 中性粒细胞弹性蛋白酶含量检测
切开分离下腔静脉，抽取静脉血5 mL，5 ℃、2500 r/min离心15 min，吸取血清，置于-70 ℃冰箱保存待测。随后，按以下方法收集支气管肺泡灌洗液：经下腔静脉抽血处死大鼠，将气管与双肺暴露，做气管下部横行切口，对右主支气管予以结扎，用接12号针头（尖端磨平）的注射器经气管切口向左肺缓慢灌注无菌生理盐水3 mL，每次灌注后立即回收灌注液，纱布过滤，重复3次。BALF离心，取其上清液移入无菌瓶内，置于-70 ℃超低温冰箱保存待测。ELISA用于定量检测大鼠血清及肺泡灌洗液中NE的浓度，操作严格按照试剂盒说明书进行。 3 统计学方法
采用SPSS11.5统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，凡符合正态分布和方差齐的数据采用方差分析，多组间两两比较采用LSD法，若方差不齐则用Tamhane方法进行两两比较。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 肺组织病理观察结果
对照组肺泡大小基本一致，肺泡壁厚度正常，外周未见炎性细胞浸润，或见极少量炎症细胞散在分布；COPD组见大量炎症细胞浸润，肉芽肿发生；寒燥组见大量炎性浸润，肉芽肿发生，部分肺纤维化；中药组见炎性浸润发生，较COPD组和寒燥组部分改善。结果见图1。
4.2 止嗽散加减方对模型大鼠肺组织表皮生长因子受体mRNA和蛋白表达的影响
与对照组比较，COPD组、寒燥组、中药组大鼠肺组织EGFR mRNA和蛋白表达明显升高（P<0.01）；中药组EGFR mRNA表达较寒燥组有下降趋势，但差异无统计学意义；中药组肺组织EGFR蛋白表达较COPD组和寒燥组明显降低（P<0.01）。结果见表1、图2。
4.3 止嗽散加减方对模型大鼠肺组织血清和肺泡灌洗液中性粒细胞弹性蛋白酶含量的影响
与对照组比较，寒燥组血清NE含量明显升高（P<0.01），中药组血清NE含量明显升高（P<0.05）；COPD组肺泡灌洗液NE含量明显升高（P<0.05），寒燥组肺泡灌洗液NE含量明显升高（P<0.01），中药组肺泡灌洗液NE含量明显升高（P<0.05）；与COPD组比较，寒燥组肺泡灌洗液NE含量明显升高（P<0.05）；与寒燥组比较，中药组肺泡灌洗液NE含量明显降低（P<0.01）。结果见表2。
5 讨论
《寓意草·与门人定议病式》把“辨高卑燥湿，五方异宜”作为“议病式”的重要内容之一；《注解伤寒论·伤寒例》更进一步明确“医之治病，当审其土地所宜”。新疆处于中国西北地区，地势高而寒冷少雨，其病多燥寒。寒燥与津液的关系密切，一方面影响津液的量，另一方面影响津液的功效，而中医的津液表现在气道则与黏液的功能相近[6]。
前期实验研究也发现，寒燥可促使COPD模型MUC5AC、MUC5B表达升高[3]。持续的气道黏液过度分泌及流变学特性的改变会导致黏液纤毛清除功能受损、丧失，使细菌定植成为可能，甚至发生炎性改变；还会导致小气道阻塞、气流受限、气体交换功能障碍，最终导致COPD进行性加重，甚至增加病死率，是影响病情及预后的独立危险因素。一系列因素可直接或间接作用于分泌细胞，致使MUC表达上调，分泌细胞过度化生，促使COPD患者气道黏液分泌量增加。其中NE是一种最大潜能的黏液促分泌剂[8]，在所有刺激黏液生成和分泌的因素中，75%的作用由NE发挥[8]。NE可同时诱导MUC5AC和MUC5B表达增高，且具有浓度依赖趋势[9]。NE不可逆转地改变了Clara细胞正常呈现的黏蛋白特征，导致产生异常的黏液[10]。而MUC5AC的合成受EGFR信号传递系统调节[11]，EGFR在COPD患者气道MUC的合成中发挥重要作用[12]。
本研究发现，COPD组、寒燥组和中药组模型大鼠肺部EGFR mRNA和蛋白表达均较对照组升高，寒燥对大鼠模型EGFR mRNA和蛋白表达的影响不大，而止嗽散加减方可降低COPD寒燥模型肺组织EGFR蛋白的表达。COPD组、寒燥组和中药组血清和肺泡灌洗液NE含量较对照组升高；同时，寒燥增加COPD模型大鼠肺泡灌洗液NE的含量，止嗽散加减方则可降低COPD寒燥模型大鼠肺泡灌洗液NE含量。
综上所述，本研究发现止嗽散加减方可降低COPD寒燥模型大鼠肺组织EGFR和NE的水平，这可能是该方理肺祛痰治疗COPD的机制之一。
参考文献：
[1] 高振，李风森，荆晶，等.新疆和内地慢性阻塞性肺疾病中医特点的对比研究[J].中华中医药杂志，2015，30（1）：195-198.
[2] 李风森，高振，荆晶，等.慢性阻塞性肺疾病西北寒燥证分布及临床特点[J].中国中医药信息杂志，2012，19（2）：22-24.
[3] GAO Z， UPUR H， WANG J， et al. Expression of airway mucus-associated proteins in rats with chronic obstructive pulmonary disease with a cold-dryness symptom pattern[J]. Journal of Traditional Chinese Medicine，2016，36（5）：671-677.
[4] GAO Z， LI F S， UPUR H， et al. Effect of cold-dryness on pulmonary and immunologic function in chronic obstructive pulmonary disease model rats[J]. J ournal of Traditional Chinese Mmedicine，2014， 34（2）：221-226.
[5] 高振，李风森，王晶，等.止嗽散加减方对慢性阻塞性肺疾病西北寒燥证大鼠模型肺功能的影响[J].中国中西医结合杂志，2014，34（5）：556-561.
[6] 王劍，徐志伟，严灿，等.从黏液类物质病理改变探讨痰证机理[J].上海中医药杂志，2007，30（6）：461-463.
[7] KISHIOKA K， OKAMOTO K， KIM J， et al. Regulation of secretion from mucous and serous cells in the excised ferret trachea[J]. Respir Physiol，2001，126（2）：163-171.
[8] 徐晓艳，周向东.中性粒细胞弹性蛋白酶与黏蛋白[J].中国药物与临床，2004，4（10）：741-744.
[9] 兰箭，孙航，刘杞，等.人中性粒细胞弹性蛋白酶诱导气道黏液高分泌细胞模型的建立及其机制的初步研究[J].中国生物工程杂志，2008， 28（3）：1-7.
[10] JAMIL S， BREUER R， CHRISTENSEN T G. Abnormal mucous cell phenotype induced by neutrophil elastase in hamster bronchi[J]. Exp Lung Res，1997，23（4）：285-295.
[11] TAKEYAMA K， DABBAGH K， LEE H M， et al. Epidermal growth factor system regulates mucin production in airways[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1999，96（6）：3081-3086.
[12] 毛翎，白春学，张敏，等.表皮生长因子受体和黏蛋白在慢性阻塞性肺疾病气道中的表达及意义[J].中华结核和呼吸杂志，2004，27（9）：585- 588.
（收稿日期：2017-02-14）
（修回日期：2017-03-07；编辑：华强）