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【摘要】 目的：观察软骨细胞复合纤维蛋白胶植入修复兔关节软骨缺损的效果。方法：用硫酸铵沉淀法从兔血液中提取纤维蛋白并且制备纤维蛋白胶；建立兔关节软骨缺损模型，编号，将40只新西兰兔分为实验组及空白对照组，实验组植入复合物，空白对照组不进行任何植入处理。分别于术后4、8、12周取材料，进行大体、甲苯胺蓝以及组织学的观察，判断关节软骨细胞缺损的修复情况。结果：实验组实验12周时可以修复膝关节软骨的缺失，以透明的软骨组织为主，修复效果明显优于空白对照组。结论：软骨细胞复合纤维蛋白可以很好地修复关节软骨的缺损，可以考虑用于再生修复软骨的缺损。
【关键词】 纤维蛋白胶； 软骨缺损； 硫酸铵沉淀
【Abstract】 Objective：To observe the effect of the compound fibrin glue on repairing articular cartilage defect of rabbit.Method：The fibrin was extracted from rabbit blood by ammonium sulfate precipitation method and prepared fibrin glue.The defect model of rabbit articular cartilage was established，then numbered.The 40 New Zealand rabbits were divided into the experimental group and the blank control group，the experimental group was implanted composite，the blank control group without any implant treatment.The materials were taken respectively after 4，8，12 weeks，underwent the generally，toluidine blue staining and histological observation，the repair of articular cartilage defect was judged.Result：In the experimental group，the defect of the articular cartilage was repaired at 12 weeks，and the tissue of the cartilage was transparent，and the effect of the repair was better than that of the blank control group.Conclusion：Chondrocytes complex fibrin can be a good repair for articular cartilage defects，can be considered for the regeneration of cartilage defects.
【Key words】 Fibrin glue； Cartilage defects； Ammonium sulfate precipitation
First-author’s address： Zhongshan Sanxiang Hospital， Zhongshan 528463， China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.35.006
、
关节软骨缺损主要是由机械外伤或者炎症等原因造成，据研究数据显示关节软骨缺损的临床发生率大概为5%左右[1]。早在1968年Chestenman等[2]已经报道采用软骨细胞来修复关节软骨。为了能够使得植入的细胞很好地固定于关节软骨缺损处，需要一个比较合乎要求的移植载体。传统的载体选择一般都为商品化的人纤维蛋白胶，但是在美国考虑疾病的传播而被限制使用。硫酸铵沉淀法是比较简便的一种制备纤维蛋白原的方法，并且可以避免疾病传播。笔者在查阅相关文献时发现目前采用该方法制备纤维蛋白胶修复关节软骨缺损的报道较少，因此决定采用自体的软骨细胞符合纤维蛋白修复兔关节缺损，并收到比较理想实验结果，现将实验整理作如下报道。
1 材料与方法
1.1 实验材料 凝血酶原购自杭州康恩贝公司，氯化钙以及枸橼酸钠为分析纯，40只新西兰兔购自上海医药工业研究所，体重范围2～3 kg，雌雄部分，随机分为实验组以及空白对照组，其余的药品参考綦惠等[3]报道中所用试剂。
1.2 方法
1.2.1 自体软骨细胞的分析和培养 对实验组的兔子进行编号，采用3%的异戊巴比妥经耳缘进行麻醉，在无菌的条件下削取右侧股骨滑车的关节软骨。
1.2.2 制备生物胶原蛋白 用A、B两种液体混合而成。凝血酶、Ca2+为A液主要成分，其中含有400 IU/mL的凝血酶和40 mmol/L的Ca2+。纤维蛋白、XⅢ因子是B液主要成分，含有60 g/L的纤维蛋白原以及30 U/mL的XⅢ因子。软骨细胞和纤维蛋白复合参考文献[4]的报道。
1.2.3 分离软骨细胞 取实验兔的膝关节股骨髁软骨组织。将其剪成块状，PBS冲洗，剪碎，离心，加入2% Ⅱ型胶原酶溶液，然后37 ℃、5% CO饱和溶液培育3 h，然后800 r/min，离心5 min，收集离心后的细胞、再用PBS冲洗3次。
1.2.4 模型制备 将大兔仰卧于手术台，3%的异戊巴比妥经耳缘进行麻醉，切口在膝外侧，在股骨外侧的髁关节面进行抽取软骨，直径为3 mm缺损做在关节平面，纵向钻入3 mm，直达骨髓腔。 1.2.5 分组 将已经编号的40只大兔分为实验组和对照组。实验组兔膝关节软骨缺损区植入含有软骨细胞和纤维蛋白复合物，空白对照组不做任何植入处理。分别在第4、8、12周进行处死取材，用10%体积分数的甲醛固定，30%甲酸脱钙，石蜡进行包埋然后制备成4 μm的切片。
1.3 观察项目 苏木精-伊红染色和大体实验观察修复组织学的效果，用甲苯胺蓝染色观察修复后透明软骨形成情况。
2 结果
2.1 实验观察情况 所用实验兔膝关节活动正常，关节无粘连现象、没有发现滑膜增生和关节游离，显示关节液清亮。实验组4～8周，半透明、软骨样组织替代缺损，并且边界模糊，表面光滑。对照组4～8周发现色泽比较灰暗，表面出现凹凸不平，在12周时出现虫蚀样，创面边界模糊不清。
2.2 组织学结果 造模12周后用苏木精-伊红对两组切片进行染色，结果实验组修复的组织透明，软骨厚度接近正常，与周围软骨结合较完好，有梭型纤维样的细胞在表层出现，软骨有陷窝，深层的软骨已经出现钙化和底层的软骨紧密结合。对照组缺损的软骨部位只生成少量纤维组织，经过修复的地方比较薄。
2.3 甲苯胺蓝染色情况 造模12周后对两组切片进行甲苯胺蓝染色。实验组染色为阳性，缺损处于周围正常组织界限不清晰。空白对照组切片的甲苯胺蓝染色结果为阴性。
3 讨论
如何找到合适的载体为修复的主要任务。理想的载体应该具备以下几个优点：（1）与宿主细胞有良好相容性；（2）有理想三维结构；（3）具有良好可塑性，可以将其制备成所需形状；（4）有生物降解性质[5-7]。传统的载体选择一般都为商品化的人纤维蛋白胶，但是在美国因为考虑疾病的传播而被限制使用。硫酸铵沉淀法是比较简便的一种制备纤维蛋白原的方法，并且可以避免疾病传播。在本次的使用中发现其具有较理想的实用性。
在本次的研究中，来自本身的软骨细胞和生物蛋白胶复合，对于软骨损伤的修复有理想的效果，明显优于对照组。但是在苏木精-伊红和甲苯胺蓝的颜色中显示，以纤维软骨为主的修复，所以不能完全替代原来透明软骨的功能。在甲苯胺蓝染色结果中，缺损的细胞还具有相关活性。有数据报道，自体软骨细胞在移植过程中细胞可以不用扩散而达到和体外扩增相当的修复效果[8]。
近年来也有报道使用自体软骨细胞修复关节缺损并取得良好效果的报道[9-10]。从本次试验结果来看，运用自体软骨组织病理病理切片等均显示修复效果良好。因此笔者认为，软骨细胞复合纤维蛋白可以很好地修复关节软骨的缺损，可以考虑用于再生修复软骨的缺损。
参考文献
[1]李钦宗，信金党.关节镜下微骨折术修复关节软骨缺损的研究进展[J].中国内镜杂志，2015，21（2）：166-170.
[2] Chesterman P J， Smith A U. Homotrasplantation of articular cartilage and isolated chondrocytes. An experimental study in rabbits[J]. J Bone Joint Surg Br，1968，50（1）：184-197.
[3]綦惠，孙磊，陈磊，等.脱钙骨基质与生物蛋白胶复合载体修复兔关节软骨缺损[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14（25）：4589-4593.
[4]傅捷，吴海山，周维江，等.软骨细胞纤维蛋白胶混合物修复兔关节软骨缺损的实验研究[J].第二军医大学学报，2000，21（7）：673-675.
[5] Vinater C， Mrugala D， Jorgensen C， et al. Cartilge engineering： a crucial combination of cells， biomaterials and biofactors[J]. Trends Biotechnol，2009，27（5）：307-314.
[6]王秋玲，吕玉明.组织工程修复骨及软骨缺损的现状及展望[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13（37）：7358-7362.
[7]王德芳，乔广艳，刘莉.软骨细胞与复合水凝胶的生物相容性研究[J].上海交通大学学报，2012，3（11）：1465-1466.
[8]傅捷，董肇阳，祝云利，等.关节软骨细胞的分离、培养及表皮细胞生长因子对其影响[J].第二军医大学学报，2000，21（7）：677-679.
[9]王秋玲，吕玉明.组织工程修复骨及软骨缺损的现状及展望[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13（37）：7358-7362.
[10]胡志俊，胡波，唐德志，等.兔膝关节软骨细胞的分离培养及形态学特征[J].中国组织工程研究与临床康复，2012，14（46）：8555-8556.
（收稿日期：2015-06-30） （本文编辑：王宇）
【关键词】 纤维蛋白胶； 软骨缺损； 硫酸铵沉淀
【Abstract】 Objective：To observe the effect of the compound fibrin glue on repairing articular cartilage defect of rabbit.Method：The fibrin was extracted from rabbit blood by ammonium sulfate precipitation method and prepared fibrin glue.The defect model of rabbit articular cartilage was established，then numbered.The 40 New Zealand rabbits were divided into the experimental group and the blank control group，the experimental group was implanted composite，the blank control group without any implant treatment.The materials were taken respectively after 4，8，12 weeks，underwent the generally，toluidine blue staining and histological observation，the repair of articular cartilage defect was judged.Result：In the experimental group，the defect of the articular cartilage was repaired at 12 weeks，and the tissue of the cartilage was transparent，and the effect of the repair was better than that of the blank control group.Conclusion：Chondrocytes complex fibrin can be a good repair for articular cartilage defects，can be considered for the regeneration of cartilage defects.
【Key words】 Fibrin glue； Cartilage defects； Ammonium sulfate precipitation
First-author’s address： Zhongshan Sanxiang Hospital， Zhongshan 528463， China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.35.006
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关节软骨缺损主要是由机械外伤或者炎症等原因造成，据研究数据显示关节软骨缺损的临床发生率大概为5%左右[1]。早在1968年Chestenman等[2]已经报道采用软骨细胞来修复关节软骨。为了能够使得植入的细胞很好地固定于关节软骨缺损处，需要一个比较合乎要求的移植载体。传统的载体选择一般都为商品化的人纤维蛋白胶，但是在美国考虑疾病的传播而被限制使用。硫酸铵沉淀法是比较简便的一种制备纤维蛋白原的方法，并且可以避免疾病传播。笔者在查阅相关文献时发现目前采用该方法制备纤维蛋白胶修复关节软骨缺损的报道较少，因此决定采用自体的软骨细胞符合纤维蛋白修复兔关节缺损，并收到比较理想实验结果，现将实验整理作如下报道。
1 材料与方法
1.1 实验材料 凝血酶原购自杭州康恩贝公司，氯化钙以及枸橼酸钠为分析纯，40只新西兰兔购自上海医药工业研究所，体重范围2～3 kg，雌雄部分，随机分为实验组以及空白对照组，其余的药品参考綦惠等[3]报道中所用试剂。
1.2 方法
1.2.1 自体软骨细胞的分析和培养 对实验组的兔子进行编号，采用3%的异戊巴比妥经耳缘进行麻醉，在无菌的条件下削取右侧股骨滑车的关节软骨。
1.2.2 制备生物胶原蛋白 用A、B两种液体混合而成。凝血酶、Ca2+为A液主要成分，其中含有400 IU/mL的凝血酶和40 mmol/L的Ca2+。纤维蛋白、XⅢ因子是B液主要成分，含有60 g/L的纤维蛋白原以及30 U/mL的XⅢ因子。软骨细胞和纤维蛋白复合参考文献[4]的报道。
1.2.3 分离软骨细胞 取实验兔的膝关节股骨髁软骨组织。将其剪成块状，PBS冲洗，剪碎，离心，加入2% Ⅱ型胶原酶溶液，然后37 ℃、5% CO饱和溶液培育3 h，然后800 r/min，离心5 min，收集离心后的细胞、再用PBS冲洗3次。
1.2.4 模型制备 将大兔仰卧于手术台，3%的异戊巴比妥经耳缘进行麻醉，切口在膝外侧，在股骨外侧的髁关节面进行抽取软骨，直径为3 mm缺损做在关节平面，纵向钻入3 mm，直达骨髓腔。 1.2.5 分组 将已经编号的40只大兔分为实验组和对照组。实验组兔膝关节软骨缺损区植入含有软骨细胞和纤维蛋白复合物，空白对照组不做任何植入处理。分别在第4、8、12周进行处死取材，用10%体积分数的甲醛固定，30%甲酸脱钙，石蜡进行包埋然后制备成4 μm的切片。
1.3 观察项目 苏木精-伊红染色和大体实验观察修复组织学的效果，用甲苯胺蓝染色观察修复后透明软骨形成情况。
2 结果
2.1 实验观察情况 所用实验兔膝关节活动正常，关节无粘连现象、没有发现滑膜增生和关节游离，显示关节液清亮。实验组4～8周，半透明、软骨样组织替代缺损，并且边界模糊，表面光滑。对照组4～8周发现色泽比较灰暗，表面出现凹凸不平，在12周时出现虫蚀样，创面边界模糊不清。
2.2 组织学结果 造模12周后用苏木精-伊红对两组切片进行染色，结果实验组修复的组织透明，软骨厚度接近正常，与周围软骨结合较完好，有梭型纤维样的细胞在表层出现，软骨有陷窝，深层的软骨已经出现钙化和底层的软骨紧密结合。对照组缺损的软骨部位只生成少量纤维组织，经过修复的地方比较薄。
2.3 甲苯胺蓝染色情况 造模12周后对两组切片进行甲苯胺蓝染色。实验组染色为阳性，缺损处于周围正常组织界限不清晰。空白对照组切片的甲苯胺蓝染色结果为阴性。
3 讨论
如何找到合适的载体为修复的主要任务。理想的载体应该具备以下几个优点：（1）与宿主细胞有良好相容性；（2）有理想三维结构；（3）具有良好可塑性，可以将其制备成所需形状；（4）有生物降解性质[5-7]。传统的载体选择一般都为商品化的人纤维蛋白胶，但是在美国因为考虑疾病的传播而被限制使用。硫酸铵沉淀法是比较简便的一种制备纤维蛋白原的方法，并且可以避免疾病传播。在本次的使用中发现其具有较理想的实用性。
在本次的研究中，来自本身的软骨细胞和生物蛋白胶复合，对于软骨损伤的修复有理想的效果，明显优于对照组。但是在苏木精-伊红和甲苯胺蓝的颜色中显示，以纤维软骨为主的修复，所以不能完全替代原来透明软骨的功能。在甲苯胺蓝染色结果中，缺损的细胞还具有相关活性。有数据报道，自体软骨细胞在移植过程中细胞可以不用扩散而达到和体外扩增相当的修复效果[8]。
近年来也有报道使用自体软骨细胞修复关节缺损并取得良好效果的报道[9-10]。从本次试验结果来看，运用自体软骨组织病理病理切片等均显示修复效果良好。因此笔者认为，软骨细胞复合纤维蛋白可以很好地修复关节软骨的缺损，可以考虑用于再生修复软骨的缺损。
参考文献
[1]李钦宗，信金党.关节镜下微骨折术修复关节软骨缺损的研究进展[J].中国内镜杂志，2015，21（2）：166-170.
[2] Chesterman P J， Smith A U. Homotrasplantation of articular cartilage and isolated chondrocytes. An experimental study in rabbits[J]. J Bone Joint Surg Br，1968，50（1）：184-197.
[3]綦惠，孙磊，陈磊，等.脱钙骨基质与生物蛋白胶复合载体修复兔关节软骨缺损[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14（25）：4589-4593.
[4]傅捷，吴海山，周维江，等.软骨细胞纤维蛋白胶混合物修复兔关节软骨缺损的实验研究[J].第二军医大学学报，2000，21（7）：673-675.
[5] Vinater C， Mrugala D， Jorgensen C， et al. Cartilge engineering： a crucial combination of cells， biomaterials and biofactors[J]. Trends Biotechnol，2009，27（5）：307-314.
[6]王秋玲，吕玉明.组织工程修复骨及软骨缺损的现状及展望[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13（37）：7358-7362.
[7]王德芳，乔广艳，刘莉.软骨细胞与复合水凝胶的生物相容性研究[J].上海交通大学学报，2012，3（11）：1465-1466.
[8]傅捷，董肇阳，祝云利，等.关节软骨细胞的分离、培养及表皮细胞生长因子对其影响[J].第二军医大学学报，2000，21（7）：677-679.
[9]王秋玲，吕玉明.组织工程修复骨及软骨缺损的现状及展望[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13（37）：7358-7362.
[10]胡志俊，胡波，唐德志，等.兔膝关节软骨细胞的分离培养及形态学特征[J].中国组织工程研究与临床康复，2012，14（46）：8555-8556.
（收稿日期：2015-06-30） （本文编辑：王宇）