两粤黄檀乙醇提取物化学成分分析及抗炎活性研究

来源 :广西植物 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wjdy110
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  摘 要: 为了研究壮药两粤黄檀的化学成分及其抗炎活性,阐明其药理作用机制,该研究采用小鼠二甲苯致炎耳廓肿胀法、角叉菜胶致炎足肿胀急性炎症模型,观察不同剂量两粤黄檀乙醇提取物对小鼠耳廓肿胀度、肿胀率及足肿胀度的影响,并利用液相色谱-质谱(LC-MS)、热裂解气相色谱-质谱(PY-GC/MS)等技术分析提取物的化学成分,结合网络药理学方法对其抗炎活性成分以及作用机制进行初步研究。结果表明:(1)两粤黄檀乙醇提取物具有良好的抗炎活性,高剂量组(8 g·kg-1 )可以显著抑制二甲苯致小鼠耳廓肿胀度、角叉菜胶致炎足趾肿胀,其抑制率均高于50%;(2)从两粤黄檀乙醇提取物中共鉴定得到60个化合物,包括毛蕊异黄酮、芒柄花黄素、血根碱、胡椒碱、β-谷甾醇等多种抗炎活性成分;(3)网络药理学分析显示,两粤黄檀发挥抗炎作用的核心靶点为PIK3CA、EGFR、MAPK、SRC、STAT3、CYP19A1、IL2、MAOA等,涉及cGMP-PKG、cAMP、Focal adhesion、Rap1等信號通路。该研究结果为两粤黄檀的进一步开发利用提供了重要参考。
  关键词: 两粤黄檀, LC-MS, PY-GC/MS, 抗炎, 网络药理学
  中图分类号: Q946  文献标识码: A  文章编号: 1000-3142(2021)07-1035-11
  Abstract: Dalbergia benthamii is a traditional Chinese medicine commonly used by Zhuang People in Guangxi, which was reported to possess a variety of biological activities. But their chemical constituents, anti-inflammatory activities and their possible pharmacological mechanism of D. benthamii were unclear yet. The acute inflammation of different doses of ethanol extracts of D. benthamii was observed by the mouse xylene induced ear edema and carrageenan induced paw edema models. Then, the chemical constituents analysis of the extracts were determined by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) and pyrolysis gas chromatography-mass spectrometry (PY-GC/MS). Their mechanism of anti-inflammatory activity was analyzed by network pharmacology at the same time. The results were as follows: (1) Compared with the model group, high dose group (8 g·kg-1) of ethanol extracts of D. benthamii could significantly inhibit the xylene induced mouse ear edema, carrageenan induced hind paw edema, with inhibition rate over 50%. (2) There were sixty compounds identified from the extracts, including some reported anti-inflammatory active constituents, such as isoflavone mullein, formononetin, sanguine, piperine, beta-sitosterol, etc. (3) The network pharmacological analysis were shown that the anti-inflammatory effects of D. benthamii might be related to potential targets of PIK3CA, EGFR, MAPK, SRC, STAT3, CYP19A1, IL2 and MAOA, etc., which were mainly involving signaling pathways of cGMP-PKG, cAMP, Focal adhesion and Rapl. The results will provide an important reference for the further development and utilization of the plants of D. benthamii.
  Key words: Dalbergia benthamii, LC-MS, PY-GC/MS, anti-inflammatory, network pharmacological
   两粤黄檀 (Dalbergia benthamii) 为豆科(Fabaceae)黄檀属(Dalbergia L. f.)藤本植物,别名蕉藤麻、两粤檀,产于我国海南、广东、广西等地,东南亚地区亦有分布。其药用部位为茎或根部心材,可用于通经活血,主治跌打损伤、筋骨疼痛及气滞血瘀所致月经不调等症(国家中医药管理局中华本草编委会,2005)。现代药理学研究表明两粤黄檀具有抗氧化、抗菌、抗炎等多种生物活性(霍丽妮等,2014;王昊等,2014;陈思思和石心红,2018)。两粤黄檀的化学成分日益受到研究者的关注。马换换等(2018)应用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术从两粤黄檀挥发油中共鉴定出23个化学成分,同时发现其总挥发油具有良好的抗氧化活性。韦建华等(2017)通过柱色谱、重结晶等方法从两粤黄檀乙醇提取物中分离获得14个化合物,所有化合物均为首次从该属植物中分离得到。虽然目前两粤黄檀的研究较多,但中草药一般具有多成分、多靶点及相互协同等特点,导致两粤黄檀活性成分及潜在的药用靶点尚不明确。   网络药理学正是建立在“中药有效成分-靶点-疾病”的多层次网络基础上,从整体有效性的角度,将中药有效成分和生物网络集成,通过特定节点的网络分析各成分间的相互作用关系,从而科学预测中药有效成分并阐释其作用机制,是一种基于大数据的挖掘来研究中药或中药复方潜在活性成分和作用靶点的新方法,可用于较科学、全面地评价中药成分及其作用机制(Andrew,2007)。目前,已有很多学者将网络药理学用于预测和辨识中药活性成分、作用靶点,以及用于阐明作用机制。因此,本实验在二甲苯致小鼠耳廓肿胀、对角叉菜胶致小鼠足趾肿胀炎症实验的基础上,利用液相色谱-质谱(LC-MS)及热裂解气相色谱-质谱(PY-GC/MS)联用技术,对两粤黄檀乙醇提取物的化学成分进行分析,并通过网络药理学方法系统预测其抗炎作用的分子机制,以期为该植物的深入研究和开发利用提供理论参考。
  1 材料与方法
  1.1 材料
  1.1.1 药材 两粤黄檀药材于2015年5月购于广西靖西,经广西中医药大学壮医药学院韦松基教授鉴定为豆科黄檀属植物两粤黄檀 (Dalbergia benthamii)的树干或根部心材,标本(H20150525)存放于广西中医药大学中药化学实验室。
  1.1.2 动物 昆明种SPF级小鼠共100只,体重(20±2) g,♀兼用,购于长沙市天勤生物技術有限公司,动物许可证号:SCXK(湘)2014-0011。动物实验的开展获得了广西中医药大学伦理委员会的批准。
  1.1.3 试剂与仪器 试剂:地塞米松磷酸钠注射液(1704242)购于遂成药业股份有限公司;角叉菜胶购于Sigma公司;二甲苯、苯甲酸、乙腈、乙醇均为分析纯。
  仪器:3030D型热裂解器(日本FRONTIER公司);G6110A 1200液质色谱仪(美国Agilent公司);QP2010气质联用仪(日本岛津)。
  1.1.4 数据库及数据处理软件 PubChem数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、Swiss ADME数据库(http://www.swissadme.ch)、DAVID 6.8数据库(http://david. Ncifcrf.gov/)、Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)、PDB数据库(http://www.rcsb.org/pdb/home/ home.do)、Cytoscape3.7.1软件。
  1.2 方法
  1.2.1 两粤黄檀乙醇提取物的制备 参考韦建华等(2017)的方法,取适量两粤黄檀药材粗粉,分别以10倍量95%乙醇和60%乙醇渗漉提取,合并提取液,回收溶剂,浓缩至无醇味,得到两粤黄檀乙醇总提取物,于4 ℃冰箱保存备用。
  1.2.2 抗炎活性评价
  1.2.2.1 二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验 参考黄丽贞等(2016)的方法。取雄性小鼠50只,随机分为空白组、地塞米松阳性对照组(0.006 8 g·kg-1)、两粤黄檀乙醇提取物高剂量组(8.0 g·kg-1)、黄檀中剂量组(4.0 g·kg-1)、黄檀低剂量组(2.0 g·kg-1)。除空白组灌胃蒸馏水外,其余各组给予相应剂量的药物,每天1次,每次给药量为20 mL·kg-1,连续7 d。末次给药前禁食不禁水16 h,给药后60 min分别在各组小鼠右耳滴0.02 mL二甲苯致炎,15 min后脱颈椎处死,用直径为6 mm的打孔器打下致炎小鼠的左右两耳片,称重,计算小鼠耳片肿胀度及抑肿率。
  耳肿胀度=右耳片重量-左耳片重量;
  抑肿率(%)=(对照组耳肿胀度-给药组耳肿胀度)/对照组耳肿胀度]×100。
  1.2.2.2 对角叉菜胶致小鼠足趾肿胀实验 参考黄丽贞等(2016)的方法。取50只重量在18~22 g 的雄性小鼠,随机分为空白对照组、地塞米松阳性对照组(0.006 8 g·kg-1)、黄檀高剂量组(8.0 g·kg-1)、黄檀中剂量组(4.0 g·kg-1)、黄檀低剂量组(2.0 g·kg-1)。除空白组给蒸馏水外,其余各组给予相应剂量的药物,连续7 d,每天1次,每次给药量为20 mL·kg-1。末次给药前禁食不禁水16 h,末次给药后1 h,在每只小鼠右后足注射1%角叉菜胶20 μL 致炎,用游标卡尺分别测量致炎后5 min、1 h、2 h、3 h右足的厚度及左足的厚度,肿胀度为右后足与左后足厚度的差值。
  足肿胀度=右后足厚度-左后足厚度;
  抑肿率(%)=(对照组足肿胀度-给药组足肿胀度)/对照组足肿胀度]×100。
  1.2.3 两粤黄檀乙醇提取物化学成分分析 取适量两粤黄檀乙醇提取物,以色谱级甲醇稀释后过0.22 μm有机滤膜,采用液相色谱-质谱和热裂解气相色谱-质谱联用技术分析提取物中所含化学成分。
  1.2.3.1 液相色谱-质谱分析 色谱条件:色谱柱为Chromolith Flash RP-18e 25 mm × 2 mm(铬石闪光灯RP18E 25 mm × 2 mm);流动相A为水,B为乙腈,进行梯度洗脱(洗脱程序见表1);流速为1.50 mL·min-1;柱温为50 ℃。
  
   质谱条件:离子源为电喷雾离子源;离子极性选择Positive;离子喷雾电压为3 500 V;雾化压力为60 psi;干燥气温度为350 ℃;干燥气流速为11 L·min-1;碰撞气为N2;质量扫描范围(m/z)为100~1 000。
  1.2.3.2 热裂解气相色谱-质谱分析 热裂解条件:采用3030D型热裂解器进行热裂解,裂解温度为600 ℃,热裂解为瞬时升温;色谱条件:色谱柱为HP-5MS (25 m × 250 mm × 0.25 μm),载气为He气,进样口温度为280 ℃,分流比为50∶1,流速为1 mL·min-1,色谱分析时间为40.5 min;质谱条件:电离方式为 EI,EI源电压为 70 eV,离子源温度为230 ℃,四极杆温度为150 ℃,溶剂延迟1.5 min,扫描模式为全扫描,质量扫描范围(m/z)为40~600。   WANG MY, GUO X, LIU XT, et al., 2017. Study on extraction and anti-inflammatory effect of alkaloids from traditional Chinese medicine [J]. Prog Veter Med, 38(4): 80-83. [王梦远, 郭晓, 刘晓婷, 等, 2017. 中药生物碱的提取及抗炎作用研究 [J]. 动物医学进展, 38(4): 80-83.]
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  (责任编辑 何永艳)
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