探讨慢病毒介导的磷酸二酯酶5(PDE5)基因抑制对大鼠脂肪干细胞(ADSCs)增殖、凋亡及分泌功能的影响及其可能机制。
方法(1)分离纯化大鼠ADSCs，传代培养及鉴定。构建沉默PDE5基因不同位点的3组PDE5慢病毒表达载体(PDE5 shRNA1、PDE5 shRNA2、PDE5 shRNA3)并设置阴性对照(NC shRNA)，采用慢病毒包装系统稳定转染ADSCs，应用RT-PCR检测ADSCsPDE5 mRNA表达，应用Western blotting检测ADSCs PDE5蛋白表达，以筛选出最高效的转染细胞株。(2)实验分为4组：正常细胞组、缺血-复氧(I/R)损伤细胞组(正常细胞+I/R损伤)、阴性对照组(NC shRNA-ADSCs+I/R损伤)、PDE5 shRNA-ADSCs+I/R损伤组(PDE5 sh I/R组)。采用CCK-8法及Edu法检测各组细胞24 h、48 h增殖情况，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，采用ELISA法检测上清液中血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(FGF)及细胞内环磷鸟苷(cGMP)水平。
结果成功构建了PDE5慢病毒表达载体，筛选并成功建立了稳定低表达PDE5基因的ADSCs细胞株PDE5 shRNA-ADSCs。与正常细胞组相比，I/R损伤细胞组ADSCs增殖率明显降低，早期、晚期及总凋亡率均明显增加，上清液中VEGF、FGF水平及细胞内cGMP水平明显增高，差异均有统计学意义(P<0.05) ；阴性对照组与I/R损伤细胞组比较差异均无统计学意义(P>0.05)；而与阴性对照组相比，PDE5 sh I/R组ADSCs增殖显著增加，凋亡率明显下降，且上清液中VEGF、FGF水平及细胞内cGMP水平进一步升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。
结论PDE5基因表达被抑制后可能通过上调cGMP水平，有效改善ADSCs在I/R状态下的增殖、凋亡及分泌功能，优化其效能。