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摘要 [目的]对葡萄渣提取液进行澄清，并对工艺参数进行优化。[方法]选择果胶和纤维素复合酶对葡萄籽提取物进行澄清，分别在最适温度和常温作用、最适pH和不调pH条件下比较了复合酶对葡萄籽提取液澄清效果及多酚和原花青素含量的影响。[结果]试验表明，复合酶对葡萄籽提取液澄清效果受温度的影响较大，调节pH对澄清度的影响则表现不明显。正交试验证明，最佳澄清工艺条件为pH 5.5，酶解温度45 ℃、作用时间6 h、酶剂量60 mg/kg，透光率达到76%，澄清过程中不影响葡萄籽多酚以及原花青素含量。[结论]研究可为葡萄籽提取液的开发利用提供理论依据。
关键词 葡萄籽提取液：复合酶：最佳澄清工艺：多酚以及原花青素含量
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）11-03363-03
Abstract [Objective] To clarify grape seed extract and optimize process parameters. [Methods] Selected fpectin and cellulose complex enzyme for clarification effect of grape seed extract， at the appropriate temperature and room temperature effects， and nonoptimal pH， appropriate pH， and compared clarification effect of grape seed extract and polyphenols and proanthocyanidins efficiency levels of complex enzyme. [Results] The results showed the effect of enzyme clarifying the grape seed extract was greatly influenced by the temperature； the effect of the adjusted pH was not significant on the clarification result. Orthogonal showed the Best clarification process condition is pH 5.5， reaction temperature 45 ℃， reaction time for 6 h， enzyme dose 60 mg/kg. Transmittance efficiency reaches 76% and the process does not affect the content of grape seed polyphenols and proanthocyanidins. [Conclusion] This study can provide certain basis for development and application of grape seed extract.
Key words Grape seed extract； Combinedenzyme； Optimal clarification process； Content of polyphenols and proanthocyanidins
葡萄酒的大量生产和消费，也产生了大量的葡萄酿酒后的副产品——葡萄废弃物（葡萄皮渣、籽、梗）[1]。葡萄渣中含有以植物多酚为主的生物活性物质，如：酚酸、原花青素、黄酮、白藜芦醇等。葡萄渣是由碳水化合物（种子8%，皮13%）、纤维（总质量的50%）、脂肪（种子4%，皮10%）、蛋白质（种子8%，皮14%）、矿物盐、木质素（种子64%，皮59%）、半纤维素（种子18%，皮31%）、纤维素（种子17.75%，皮6%）和果胶（种子0.25%，皮4%）构成[2]。在葡萄废弃物中，葡萄籽生物活性物质最丰富，其中多酚和原花青素为最主要的活性物质。
葡萄籽多酚的提取方法主要有溶剂浸提法、酶解提取法、超临界萃取法以及微波、超声波、超高压辅助提取法[3]。有机溶剂萃取是葡萄籽多酚常用的提取方法，但易造成环境污染。采用水剂法提取葡萄籽多酚，但发现葡萄籽提取物中含有大量的果胶类物质，致使提取液浑浊不清，严重影响葡萄渣提取物纯度，因杂质多，尤其是脂溶性杂质对色谱柱污染大，多糖、果胶、纤维素、半纤维素、木质素和淀粉、蛋白质等严重影响色谱柱的使用寿命。
果胶存在于大多数植物中，在果蔬中加入酶制剂水解果胶质，使果汁中其他胶体失去果胶的保护作用而聚积沉淀就可达到澄清的目的。纤维素酶、果胶酶使提取液变澄清，并且用这2种酶来提高提取物黏度，降低和簇的形成，这有利于离心或过滤分离，使提取液具有更高的清晰度和更浓缩的风味及颜色[4-5]。葡萄渣细胞壁成分主要是果胶和纤维素，加入这些酶增加了葡萄皮的降解，提高香气，有利于酚类化合物在葡萄酒中的释放，有助于稳定提取液颜色[5]。因此，笔者采用酶法对葡萄渣提取液进行澄清，并对工艺参数进行优化，为葡萄籽提取液的开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料 葡萄籽，中信国安葡萄酒业股份有限公司。发酵红葡萄酒后的红葡萄籽，粉碎60目过筛，低温干燥至恒质量后备用。主要试剂：纤维素酶（酶活力≥300 000 U/g）、果胶酶（酶活力≥20 000 U/g），上海蓝季科技发展有限公司；没食子酸，天津市兴复精细化工研究所；福林酚试剂，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。主要仪器：FW80型高速万能粉碎机，北京市永光明医疗仪器有限公司；DKB501A型恒温水浴锅，上海精宏实验设备公司；PH29A酸度计，上海精科雷磁设备公司；spectrumlab53分光光度计，上海棱光技术有限公司；RE52A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；JM5102电子天平，余姚纪铭称重校验设备有限公司。 1.2 方法
1.2.1 原料预处理。葡萄籽粉碎过60目筛→料液比按1∶7 g/ml，75 ℃水浴浸提5 h→酶解澄清→离心、静置→取上清液→测定透光度→测定多酚含量→测定原花青素含量。
1.2.2 单因素试验。
1.2.2.1 不同酶用量对葡萄籽提取液澄清效果的影响。在45 ℃、pH 5.5、酶解时间10 h条件下，考察酶用量分别为20、40、60、80、100 mg/kg对葡萄籽提取液澄清效果的影响。
1.2.2.2 不同温度对葡萄籽提取液澄清效果的影响。在pH 5.5、酶用量60 mg/kg、酶解时间10 h条件下，考察最适温度（45 ℃）和常温（18 ℃）对葡萄籽提取液澄清效果的影响。
1.2.2.3 不同pH对葡萄籽提取液澄清效果的影响。在45 ℃、酶用量60 mg/kg、酶解时间10 h条件下，考察最适pH（pH 5.5）和不调pH（pH 3.5）对葡萄籽提取物澄清效果的影响。
3 结论与讨论
复合酶澄清葡萄籽提取液单因素试验表明，常温处理和45 ℃水浴处理对葡萄籽提取液的影响极为显著。45 ℃水浴酶解不但使酶促反应速率加快，还能提高汁体的透光率。适当地调节pH使之接近最适值可改善澄清效果。酶的用量应控制在60 mg/kg，较低的剂量导致处理效果不佳，较高则成本高，还会引起蛋白性浑浊。正交试验表明，最佳澄清工艺条件为：pH 5.5，酶解温度45 ℃，作用时间6 h，酶剂量60 mg/kg，颜色光亮自然。并且由多酚以及原花青素含量比较可以看出，在澄清过程中多酚以及原花青素含量不受影响。
42卷11期 伊丽孜拉·吐尔干等 复合酶法澄清葡萄籽提取液工艺研究
参考文献
[1]
刘树文. 葡萄与葡萄酒中白藜芦醇的研究进展[J].西北植物学报，1999，5（5）：144-148.
[2] BOTELLA C，DE ORY I，WEB C，et al.Hydrolytic enzymes production by Aspergillus awamori on grape pomace[J].Biochemical Engineering Journal，2005，26：100-106.
[3] 春艳，姜晓坤.葡萄皮渣中多酚物质提取工艺的研究[J].辽宁化工，2011，40（9）：917-919.
[4] CELESTINO M，FREITAS M，MEDRANO J，et al.Purification and characterization of a novel pectinase from Acrophialophora nainiana with emphasis on its physicochemical properties[J].Journal of Biotechnology，2006，123：33-42.
[5] CELESTINO M，FREITAS M，MEDRANO J，et al.Purification and characterization of a novel pectinase from Acrophialophora nainiana with emphasis on its physicochemical properties[J].Journal of Biotechnology，2006，123：33-42.
[6] REHM H，REED G.Biotechnology：Enzymes，biomass，food and feed，Vol.9[M].Weinheim，Germany：VCH，1996.
[7] 邢洁，王尚义，张久红，等.果胶酶澄清沙棘果汁最佳工艺研究[J] .沙棘，2006（1）：20-23.
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[8] SINGLETON V L，ORTHOFER R，LAMUELARAVENTOS R M.Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of FolinCiocalteu reagent [J].Methods in Enzymology，1999，299：152-178.
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[10] 孟鹏，郑宝东.酶法高透光率青梅汁生产工艺的研究[J].农产品加工，2006（4）：43-45.
[11] CARRILLO F，LIS M J，COLOM X，et al.Effect of alkali pretreatment on cellulase hydrolysis of wheat straw：kinetic study[J].Process Biochem，2005，40：3360-3364.
[12] 项本平，陈亚萍.变性淀粉的黏度与透光率关系的研究[J].化工时刊，2005（1）：26-28.
关键词 葡萄籽提取液：复合酶：最佳澄清工艺：多酚以及原花青素含量
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）11-03363-03
Abstract [Objective] To clarify grape seed extract and optimize process parameters. [Methods] Selected fpectin and cellulose complex enzyme for clarification effect of grape seed extract， at the appropriate temperature and room temperature effects， and nonoptimal pH， appropriate pH， and compared clarification effect of grape seed extract and polyphenols and proanthocyanidins efficiency levels of complex enzyme. [Results] The results showed the effect of enzyme clarifying the grape seed extract was greatly influenced by the temperature； the effect of the adjusted pH was not significant on the clarification result. Orthogonal showed the Best clarification process condition is pH 5.5， reaction temperature 45 ℃， reaction time for 6 h， enzyme dose 60 mg/kg. Transmittance efficiency reaches 76% and the process does not affect the content of grape seed polyphenols and proanthocyanidins. [Conclusion] This study can provide certain basis for development and application of grape seed extract.
Key words Grape seed extract； Combinedenzyme； Optimal clarification process； Content of polyphenols and proanthocyanidins
葡萄酒的大量生产和消费，也产生了大量的葡萄酿酒后的副产品——葡萄废弃物（葡萄皮渣、籽、梗）[1]。葡萄渣中含有以植物多酚为主的生物活性物质，如：酚酸、原花青素、黄酮、白藜芦醇等。葡萄渣是由碳水化合物（种子8%，皮13%）、纤维（总质量的50%）、脂肪（种子4%，皮10%）、蛋白质（种子8%，皮14%）、矿物盐、木质素（种子64%，皮59%）、半纤维素（种子18%，皮31%）、纤维素（种子17.75%，皮6%）和果胶（种子0.25%，皮4%）构成[2]。在葡萄废弃物中，葡萄籽生物活性物质最丰富，其中多酚和原花青素为最主要的活性物质。
葡萄籽多酚的提取方法主要有溶剂浸提法、酶解提取法、超临界萃取法以及微波、超声波、超高压辅助提取法[3]。有机溶剂萃取是葡萄籽多酚常用的提取方法，但易造成环境污染。采用水剂法提取葡萄籽多酚，但发现葡萄籽提取物中含有大量的果胶类物质，致使提取液浑浊不清，严重影响葡萄渣提取物纯度，因杂质多，尤其是脂溶性杂质对色谱柱污染大，多糖、果胶、纤维素、半纤维素、木质素和淀粉、蛋白质等严重影响色谱柱的使用寿命。
果胶存在于大多数植物中，在果蔬中加入酶制剂水解果胶质，使果汁中其他胶体失去果胶的保护作用而聚积沉淀就可达到澄清的目的。纤维素酶、果胶酶使提取液变澄清，并且用这2种酶来提高提取物黏度，降低和簇的形成，这有利于离心或过滤分离，使提取液具有更高的清晰度和更浓缩的风味及颜色[4-5]。葡萄渣细胞壁成分主要是果胶和纤维素，加入这些酶增加了葡萄皮的降解，提高香气，有利于酚类化合物在葡萄酒中的释放，有助于稳定提取液颜色[5]。因此，笔者采用酶法对葡萄渣提取液进行澄清，并对工艺参数进行优化，为葡萄籽提取液的开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料 葡萄籽，中信国安葡萄酒业股份有限公司。发酵红葡萄酒后的红葡萄籽，粉碎60目过筛，低温干燥至恒质量后备用。主要试剂：纤维素酶（酶活力≥300 000 U/g）、果胶酶（酶活力≥20 000 U/g），上海蓝季科技发展有限公司；没食子酸，天津市兴复精细化工研究所；福林酚试剂，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。主要仪器：FW80型高速万能粉碎机，北京市永光明医疗仪器有限公司；DKB501A型恒温水浴锅，上海精宏实验设备公司；PH29A酸度计，上海精科雷磁设备公司；spectrumlab53分光光度计，上海棱光技术有限公司；RE52A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；JM5102电子天平，余姚纪铭称重校验设备有限公司。 1.2 方法
1.2.1 原料预处理。葡萄籽粉碎过60目筛→料液比按1∶7 g/ml，75 ℃水浴浸提5 h→酶解澄清→离心、静置→取上清液→测定透光度→测定多酚含量→测定原花青素含量。
1.2.2 单因素试验。
1.2.2.1 不同酶用量对葡萄籽提取液澄清效果的影响。在45 ℃、pH 5.5、酶解时间10 h条件下，考察酶用量分别为20、40、60、80、100 mg/kg对葡萄籽提取液澄清效果的影响。
1.2.2.2 不同温度对葡萄籽提取液澄清效果的影响。在pH 5.5、酶用量60 mg/kg、酶解时间10 h条件下，考察最适温度（45 ℃）和常温（18 ℃）对葡萄籽提取液澄清效果的影响。
1.2.2.3 不同pH对葡萄籽提取液澄清效果的影响。在45 ℃、酶用量60 mg/kg、酶解时间10 h条件下，考察最适pH（pH 5.5）和不调pH（pH 3.5）对葡萄籽提取物澄清效果的影响。
3 结论与讨论
复合酶澄清葡萄籽提取液单因素试验表明，常温处理和45 ℃水浴处理对葡萄籽提取液的影响极为显著。45 ℃水浴酶解不但使酶促反应速率加快，还能提高汁体的透光率。适当地调节pH使之接近最适值可改善澄清效果。酶的用量应控制在60 mg/kg，较低的剂量导致处理效果不佳，较高则成本高，还会引起蛋白性浑浊。正交试验表明，最佳澄清工艺条件为：pH 5.5，酶解温度45 ℃，作用时间6 h，酶剂量60 mg/kg，颜色光亮自然。并且由多酚以及原花青素含量比较可以看出，在澄清过程中多酚以及原花青素含量不受影响。
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