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摘 要：变性梯度凝胶电泳技术（DGGE）已经成为环境微生物多样性分析以及生态学研究中的重要技术，但昂贵的进口设备和比较复杂的操作，使得该技术在基层技术部门以及高等院校人才培养中的应用受到了限制。研究针对国产DGGE系统，采用研发的土壤DNA提取方法，以土壤细菌总DNA为模板，分别从DGGE电泳时间、引物实习、染色方法等方面进行了PCR-DGGE技术优化研究，获得了一整套的PCR-DGGE优化技术，试验结果稳定、可靠、重现性好，分辨率高，实用价值大。技术的主要关键点有：引物对10F/1507R和引物对BV34F/BV56GC的巢氏PCR效果最佳。DGGE上样量50ul时在国产DGGE系统上DGGE胶浓度为6%、变性梯度为40%～60%、100V×12h、温度60℃、EB染色15min，得到的DGGE指纹图谱效果理想，该优化技术完全可以满足对土壤细菌遗传多样性分析的要求，且运行成本低，对促进土壤微生物多样性的研究与相关教学实践具有重要意义。
关键词：土壤；细菌；多样性；DGGE
土壤中微生物种类极其丰富，文献曾报道，1g农田土壤中就含有几百万细菌、数十万真菌孢子和数万个原生动物和藻类[1]。微生物以它所具有的各种生物化学活性 ，积极参与土壤中各种物质的转化过程 ，是土壤中各种生物化学和生理学过程动态平衡的主要调节者。目前在生态学和环境科学的研究领域，关于土壤微生物尤其是土壤中微生物多样性及其在生态系统中的作用的研究越来越受到重视；而传统的平板培养分离方法研究土壤微生物多样性有很大的缺陷，能够人工培养的土壤微生物的数量只占其总数的1%左右[2]，且这种分离培养方法不能很好地反映土壤微生物多样性的原始状态等[3]，这就使得采用新的技术和方法显得尤为必要。
变性梯度凝胶电泳技术（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）作为一种DNA指纹图谱技术，最先由Muzyer等于1993年将其应用于微生物生态学研究[4]，证实了该技术在研究自然界微生物群落的种群差异和遗传多样性方面具有明显的优越性。DGGE因其可靠、方便快捷、重现性好等特点，迅速成为微生物群落多样性和动态分析的强有力工具[5]。目前广泛运用于土壤、水体、食品、活性污泥等各种样品中的微生物多样性检测和种群演替的分析[6～9]。但昂贵的进口设备和比较复杂的操作，使得该技术在基层技术部门以及高等院校人才培养中的应用受到了限制。因此，选用适宜的引物，并对PCR及DGGE的实验条件进行优，以获得较好的分析结果显得尤为重要。本试验优化了DGGE电泳时间长度，筛选了最佳PCR引物，比较了两种染色方法，得到了在国产DGGE系统分析土壤微生物多样性的最佳条件。
1、材料与方法
1.1、试验材料
试验土壤样品21个，于2011年9月采自许昌市襄城县庾河村烟田。烤烟品种为当地主栽品种中烟100，种植方式为烟薯套种。对采集的土样自然风干，研磨过100#筛子，装袋标记，置于-20℃冰箱内以备用。
1.2、试验方法
1.2.1、土壤总DNA的提取
对处理过的土样采用本实验室优化方法提取土样总DNA。
1.2.2、PCR引物的设计和扩增体系的探索
（1） 引物合成
根据NCBI数据库公开的细菌基因组16S保守序列设计了4对细菌通用引物：引物对Eubac10F/Eubac1507R用于第一轮扩增，引物对BV34F/BV56GC、BV67F/BV89GC和BacGC-P2/BacGC-P3用于第二轮扩增，对样品总DNA进行巢氏PCR扩增。为了便于对污染源进行追踪，在PCR扩增过程中，都设立了阴性对照。对照除了不加模板DNA外，其它组分全部相同。引物序列均由北京博尚生物技术有限公司进行合成，详见表1：
（3）巢式PCR扩增条件：
引物对Eubac10F/Eubac1507R的第一轮PCR扩增程序为：95℃ 5min，1个循环；94℃ 50s，52℃ 50s，72℃ 1min，28个循环；72℃延伸10 min。PCR产物用1%的琼脂糖电泳。
引物对BV34F/BV56GC的第二轮PCR扩增程序为：95℃ 5min，1个循环；94℃ 40s，52℃ 45s，72℃ 45s，28个循环；72℃延伸10 min。PCR产物用1%的琼脂糖电泳检测后用于DGGE电泳检测。
引物对BV67F/BV89GC的第二轮PCR扩增程序为：95℃ 5min，1个循环；94℃ 40s，54℃ 45s，72℃ 45s，28个循环；72℃延伸10 min。PCR产物用1%的琼脂糖电泳检测后用于DGGE电泳检测。
引物对BacGC-P2/BacGC-P3的第二轮PCR扩增程序为：95℃ 5min，1个循环；94℃ 40s，57℃ 45s，72℃ 45s，28个循环；72℃延伸10 min。PCR产物用1%的琼脂糖电泳检测后用于DGGE电泳检测。
1.2.3、DGGE电泳时间长度的优化
采用北京君意公司的梯度胶制备装置（型号JY-TD331）进行垂直电泳。使用梯度混合器，配制聚丙烯酰胺凝胶的变性剂浓度梯度40%～ 60% （100%的变性剂为7mol/L的尿素和40%的去离子甲酰胺的混合物），凝胶浓度为6%，以引物对Eubac10F/Eubac1507R和引物对BV34F/BV56G的巢氏PCR产物为上样模板，上样50ul。设置电泳温度60℃，电压100V。电泳过程中，每2h上一次样。电泳结束后，用EB染色15min。染色后凝胶用BIO IMAGING（美国UVP GelDoc-It Imaging Systems）的凝胶成像系统拍照。
1.2.4、DGGE最佳引物对的筛选 配制聚丙烯酰胺凝胶的变性剂浓度梯度40%～60%，凝胶浓度为6%，以引物对BV34F/BV56GC、引物对BV67F/BV89GC和引物对BacGC-P2/BacGC-P3的相同样品的第二轮PCR产物为上样模板，根据上述已优化的电泳时间和条件进行电泳。电泳结束后染色照相。
1.2.5、EB和硝酸银两种DGGE染色方法的比较
根据上述已优化的电泳时间和最佳引物平行的跑两块变性梯度凝胶。电泳结束后，分别用EB和硝酸银两种方法染色。通过比较两种染色方法的DGGE条带的亮度和数目得出最佳染色方法。
2、结果与分析
2.1、巢氏PCR扩增结果
扩增结果表明，细菌16S区的第一轮PCR扩增条带亮度高，其大小约为1500bp，符合预期，且无非特异性扩增，阴性对照无条带。分别以BV34F/BV56GC、BV67F/BV89GC和BacGC-P2/BacGC-P3的第二轮扩增得到的条带片段的大小都符合预期，且无非特异性扩增，阴性对照无条带，说明巢式PCR扩增效果好，能够满足DGGE上样要求。
2.2、DGGE电泳时间长度的优化
选取的3个样品的巢氏PCR产物（以10F/1507R和BV34F/BV56GC的巢氏PCR产物为例）每隔2h加一次样，以确定最佳电泳时间。从图1可看出，电泳时间8～10h时，DGGE条带没有完全分离；而电泳时间14h时，条带整体过于偏下方，因此确定12h为最佳电泳时间。
2.3、最佳引物对筛选
选取5个样品，分别以引物对BV34F/BV56GC、引物对BV67F/BV89GC和引物对BacGC-P2/BacGC-P3的第二轮PCR扩增产物为样品，根据上述已优化的条件平行跑三块变性梯度凝胶，三块胶除引物不同，其他条件完全相同。染色照相以观察样品条带。从图2可知，以引物对BV34F/BV56GC的第二轮PCR扩增产物的DGGE条带数量多且亮，而以引物对BV67F/BV89GC和引物对BacGC-P2/BacGC-P3的第二轮PCR扩增产物条带数较少并且亮度不高。因此，选用10F/1507R和BV34F/BV56GC为组合进行巢氏PCR扩增和微生物多样性测定。
2.4、EB和硝酸银两种DGGE染色方法的比较
选取5个样品，以引物对10F/1507R和BV34F/56GC的巢氏PCR产物为上样模板，根据上述以优化的DGGE条件平行的跑两块变性梯度凝胶。电泳结束后，两块胶分别用EB和硝酸银染色。试验结果如图3所示， EB染色图谱清晰，且操作简单，染色条件要求不是太苛刻；硝酸银染色方法虽然灵敏性较高，但是操作复杂，每一步都要求非常精确。因此，选用EB对变性梯度凝胶染色。
3、讨论
PCR—DGGE技术能够直观的体现出一个环境样本的细菌群落组成和多样性，推测出优势 种群，并可实现对多个样品的快速同时分析，这是传统的研究方法所无法比拟的。尽管DGGE技术存在一定的缺陷，但因其重现性强、可靠性高，可同时分析多个样品，提供了群落中优势种群信息，弥补了传统方法在分析微生物群落结构方面的不足，已成为现代环境微生物生态学领域一种重要研究手段。
注：文中1～10表示不同的土样
参考文献：
[1] Chi Z M. Microbiology Ecology. Shan Dong University Publishing House. China，1999.
[2] KIRK J L，BEAUDETIE LA，HARTM，et a1.Methods of studying soil microbial diversity [J].Journal of Microbiological Method，2004，58：169—188.
[3] Amann R I，Ludwig W.Schleifer K H.Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation.Microbio1.Rev.1995，59（1）：143～169.
[4] Muyzer G，Wall E C，Uitterlinden A G.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis an alysis of polymerase chain reaction amplified genes encoding for 16S rRNA[J].Appl Environ Microbiol，1993，59（3）：695—700.
[5] Muyzer G.DGGE/TGGE a method for identifying genes from natural ecosystems[J].Curr Opin Microbiol，1999，2（3）：17—22.
[6] 刘恩科，赵秉强.长期施肥对土壤微生物量及土壤酶活性的影响[J].植物生态学报，2008，32（1）：176—182.
[7] 柳栋升，王海燕，杨慧芬，等.DGGE技术在废水生物脱氮系统中的应用研究进展[J].安徽农业科学， 2011，39（19）：11695—11697.
[8] 李苗云，周光宏，徐幸莲.应用PCR—DGGE研究冷却猪肉贮藏过程中的优势菌[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2008年56（9）：185～189.
[ 9] Maarit NR，Ilse H，Kaisa W，et a1.Extraction and purification in rhizosphere soil samples for PCR—DGGE analysis of bacteria consortia[J].Journal of Microbiological Methods，2001，45：155—165.
基金项目：河南省烟草公司科技攻关项目（项目编号HYKJ200814）。
*通讯作者：蒋士君，（1964-），男，副教授。
作者简介：乔保明，（1988-），男，河南开封人，硕士研究生，从事土传病害与土壤健康机理研究。
关键词：土壤；细菌；多样性；DGGE
土壤中微生物种类极其丰富，文献曾报道，1g农田土壤中就含有几百万细菌、数十万真菌孢子和数万个原生动物和藻类[1]。微生物以它所具有的各种生物化学活性 ，积极参与土壤中各种物质的转化过程 ，是土壤中各种生物化学和生理学过程动态平衡的主要调节者。目前在生态学和环境科学的研究领域，关于土壤微生物尤其是土壤中微生物多样性及其在生态系统中的作用的研究越来越受到重视；而传统的平板培养分离方法研究土壤微生物多样性有很大的缺陷，能够人工培养的土壤微生物的数量只占其总数的1%左右[2]，且这种分离培养方法不能很好地反映土壤微生物多样性的原始状态等[3]，这就使得采用新的技术和方法显得尤为必要。
变性梯度凝胶电泳技术（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）作为一种DNA指纹图谱技术，最先由Muzyer等于1993年将其应用于微生物生态学研究[4]，证实了该技术在研究自然界微生物群落的种群差异和遗传多样性方面具有明显的优越性。DGGE因其可靠、方便快捷、重现性好等特点，迅速成为微生物群落多样性和动态分析的强有力工具[5]。目前广泛运用于土壤、水体、食品、活性污泥等各种样品中的微生物多样性检测和种群演替的分析[6～9]。但昂贵的进口设备和比较复杂的操作，使得该技术在基层技术部门以及高等院校人才培养中的应用受到了限制。因此，选用适宜的引物，并对PCR及DGGE的实验条件进行优，以获得较好的分析结果显得尤为重要。本试验优化了DGGE电泳时间长度，筛选了最佳PCR引物，比较了两种染色方法，得到了在国产DGGE系统分析土壤微生物多样性的最佳条件。
1、材料与方法
1.1、试验材料
试验土壤样品21个，于2011年9月采自许昌市襄城县庾河村烟田。烤烟品种为当地主栽品种中烟100，种植方式为烟薯套种。对采集的土样自然风干，研磨过100#筛子，装袋标记，置于-20℃冰箱内以备用。
1.2、试验方法
1.2.1、土壤总DNA的提取
对处理过的土样采用本实验室优化方法提取土样总DNA。
1.2.2、PCR引物的设计和扩增体系的探索
（1） 引物合成
根据NCBI数据库公开的细菌基因组16S保守序列设计了4对细菌通用引物：引物对Eubac10F/Eubac1507R用于第一轮扩增，引物对BV34F/BV56GC、BV67F/BV89GC和BacGC-P2/BacGC-P3用于第二轮扩增，对样品总DNA进行巢氏PCR扩增。为了便于对污染源进行追踪，在PCR扩增过程中，都设立了阴性对照。对照除了不加模板DNA外，其它组分全部相同。引物序列均由北京博尚生物技术有限公司进行合成，详见表1：
（3）巢式PCR扩增条件：
引物对Eubac10F/Eubac1507R的第一轮PCR扩增程序为：95℃ 5min，1个循环；94℃ 50s，52℃ 50s，72℃ 1min，28个循环；72℃延伸10 min。PCR产物用1%的琼脂糖电泳。
引物对BV34F/BV56GC的第二轮PCR扩增程序为：95℃ 5min，1个循环；94℃ 40s，52℃ 45s，72℃ 45s，28个循环；72℃延伸10 min。PCR产物用1%的琼脂糖电泳检测后用于DGGE电泳检测。
引物对BV67F/BV89GC的第二轮PCR扩增程序为：95℃ 5min，1个循环；94℃ 40s，54℃ 45s，72℃ 45s，28个循环；72℃延伸10 min。PCR产物用1%的琼脂糖电泳检测后用于DGGE电泳检测。
引物对BacGC-P2/BacGC-P3的第二轮PCR扩增程序为：95℃ 5min，1个循环；94℃ 40s，57℃ 45s，72℃ 45s，28个循环；72℃延伸10 min。PCR产物用1%的琼脂糖电泳检测后用于DGGE电泳检测。
1.2.3、DGGE电泳时间长度的优化
采用北京君意公司的梯度胶制备装置（型号JY-TD331）进行垂直电泳。使用梯度混合器，配制聚丙烯酰胺凝胶的变性剂浓度梯度40%～ 60% （100%的变性剂为7mol/L的尿素和40%的去离子甲酰胺的混合物），凝胶浓度为6%，以引物对Eubac10F/Eubac1507R和引物对BV34F/BV56G的巢氏PCR产物为上样模板，上样50ul。设置电泳温度60℃，电压100V。电泳过程中，每2h上一次样。电泳结束后，用EB染色15min。染色后凝胶用BIO IMAGING（美国UVP GelDoc-It Imaging Systems）的凝胶成像系统拍照。
1.2.4、DGGE最佳引物对的筛选 配制聚丙烯酰胺凝胶的变性剂浓度梯度40%～60%，凝胶浓度为6%，以引物对BV34F/BV56GC、引物对BV67F/BV89GC和引物对BacGC-P2/BacGC-P3的相同样品的第二轮PCR产物为上样模板，根据上述已优化的电泳时间和条件进行电泳。电泳结束后染色照相。
1.2.5、EB和硝酸银两种DGGE染色方法的比较
根据上述已优化的电泳时间和最佳引物平行的跑两块变性梯度凝胶。电泳结束后，分别用EB和硝酸银两种方法染色。通过比较两种染色方法的DGGE条带的亮度和数目得出最佳染色方法。
2、结果与分析
2.1、巢氏PCR扩增结果
扩增结果表明，细菌16S区的第一轮PCR扩增条带亮度高，其大小约为1500bp，符合预期，且无非特异性扩增，阴性对照无条带。分别以BV34F/BV56GC、BV67F/BV89GC和BacGC-P2/BacGC-P3的第二轮扩增得到的条带片段的大小都符合预期，且无非特异性扩增，阴性对照无条带，说明巢式PCR扩增效果好，能够满足DGGE上样要求。
2.2、DGGE电泳时间长度的优化
选取的3个样品的巢氏PCR产物（以10F/1507R和BV34F/BV56GC的巢氏PCR产物为例）每隔2h加一次样，以确定最佳电泳时间。从图1可看出，电泳时间8～10h时，DGGE条带没有完全分离；而电泳时间14h时，条带整体过于偏下方，因此确定12h为最佳电泳时间。
2.3、最佳引物对筛选
选取5个样品，分别以引物对BV34F/BV56GC、引物对BV67F/BV89GC和引物对BacGC-P2/BacGC-P3的第二轮PCR扩增产物为样品，根据上述已优化的条件平行跑三块变性梯度凝胶，三块胶除引物不同，其他条件完全相同。染色照相以观察样品条带。从图2可知，以引物对BV34F/BV56GC的第二轮PCR扩增产物的DGGE条带数量多且亮，而以引物对BV67F/BV89GC和引物对BacGC-P2/BacGC-P3的第二轮PCR扩增产物条带数较少并且亮度不高。因此，选用10F/1507R和BV34F/BV56GC为组合进行巢氏PCR扩增和微生物多样性测定。
2.4、EB和硝酸银两种DGGE染色方法的比较
选取5个样品，以引物对10F/1507R和BV34F/56GC的巢氏PCR产物为上样模板，根据上述以优化的DGGE条件平行的跑两块变性梯度凝胶。电泳结束后，两块胶分别用EB和硝酸银染色。试验结果如图3所示， EB染色图谱清晰，且操作简单，染色条件要求不是太苛刻；硝酸银染色方法虽然灵敏性较高，但是操作复杂，每一步都要求非常精确。因此，选用EB对变性梯度凝胶染色。
3、讨论
PCR—DGGE技术能够直观的体现出一个环境样本的细菌群落组成和多样性，推测出优势 种群，并可实现对多个样品的快速同时分析，这是传统的研究方法所无法比拟的。尽管DGGE技术存在一定的缺陷，但因其重现性强、可靠性高，可同时分析多个样品，提供了群落中优势种群信息，弥补了传统方法在分析微生物群落结构方面的不足，已成为现代环境微生物生态学领域一种重要研究手段。
注：文中1～10表示不同的土样
参考文献：
[1] Chi Z M. Microbiology Ecology. Shan Dong University Publishing House. China，1999.
[2] KIRK J L，BEAUDETIE LA，HARTM，et a1.Methods of studying soil microbial diversity [J].Journal of Microbiological Method，2004，58：169—188.
[3] Amann R I，Ludwig W.Schleifer K H.Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation.Microbio1.Rev.1995，59（1）：143～169.
[4] Muyzer G，Wall E C，Uitterlinden A G.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis an alysis of polymerase chain reaction amplified genes encoding for 16S rRNA[J].Appl Environ Microbiol，1993，59（3）：695—700.
[5] Muyzer G.DGGE/TGGE a method for identifying genes from natural ecosystems[J].Curr Opin Microbiol，1999，2（3）：17—22.
[6] 刘恩科，赵秉强.长期施肥对土壤微生物量及土壤酶活性的影响[J].植物生态学报，2008，32（1）：176—182.
[7] 柳栋升，王海燕，杨慧芬，等.DGGE技术在废水生物脱氮系统中的应用研究进展[J].安徽农业科学， 2011，39（19）：11695—11697.
[8] 李苗云，周光宏，徐幸莲.应用PCR—DGGE研究冷却猪肉贮藏过程中的优势菌[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2008年56（9）：185～189.
[ 9] Maarit NR，Ilse H，Kaisa W，et a1.Extraction and purification in rhizosphere soil samples for PCR—DGGE analysis of bacteria consortia[J].Journal of Microbiological Methods，2001，45：155—165.
基金项目：河南省烟草公司科技攻关项目（项目编号HYKJ200814）。
*通讯作者：蒋士君，（1964-），男，副教授。
作者简介：乔保明，（1988-），男，河南开封人，硕士研究生，从事土传病害与土壤健康机理研究。