论文部分内容阅读
摘 要：为检测控制烟草青枯病抗性动态变化的QTLs，以大叶密合×长脖黄建立的158份F6代重组自交系（RIL）群体为研究对象，利用SSR和InDel标记进行基因分型，并运用JoinMap 4构建一个含有24个连锁群、覆盖2269.3 cM的遗传图谱;该图谱含有546个SSR和80个InDel标记，平均标记密度达到了3.63 cM/标记。结合2016和2017连续两年不同调查期各株系的病情指数，使用WinQTLcart 2.5软件的复合区间作图法（CIM）进行QTL定位，在2016年的4个调查期中分别检测到4、4、6和4个青枯病抗病QTLs，其表型变异解释率在5.03%～13.07%之间;而在2017年的4个调查期分别定位到7、3、6和6个青枯病抗病QTLs，其表型变异解释率在4.63%～18.18%之间。两年共检测到28个青枯病抗病QTLs，其中有7个QTLs在不同调查期中被重復定位，但没有一个QTL可以在所有调查期中出现;另外，不同调查期检测到QTL的数目与表达效应存在较大差异。这些结果表明烟草在发病的不同阶段可能有不同的抗性基因发挥作用，且其表达具有一定的时序性。
关键词：烟草;RIL群体;青枯病;动态QTL
Abstract： In order to detect the QTLs controlling the dynamic change of tobacco bacterial wilt （TBW） resistance， 158 F6 recombinant inbred lines （RIL） derived from a cross between Dayemihe and Changbohuang were selected and genotyped with SSR and InDel markers， and a genetic map with 24 linkage groups was constructed by JoinMap 4 software. The map contained 546 SSR and 80 InDel markers and covered 2269.3 cM with a mean distance of 3.63 cM between adjacent markers. QTL mapping for TBW resistance was performed by WinQTLcart 2.5 software using the composite interval mapping （CIM） method based on TBW disease indexes at different survey time points in 2016 and 2017. 4， 4， 6 and 4 TBW resistance QTLs were detected at the four survey time points in 2016， respectively; the phenotypic variances of these QTLs ranged from 5.03% to 13.07%. At the four survey time points in 2017， 7， 3， 6 and 6 QTLs for TBW resistance were detected， respectively， and their phenotypic variances varied between 4.63% and 18.18%. A total of 28 QTLs were identified in two years， seven of them were detected repeatedly in different survey time points， but none could be found at all survey time points in both years. Moreover， the number and additive effect of TBW resistance QTLs had significant changes at four survey time points in both years. These results indicated that tobacco may utilize different TBW resistance genes at different stages during the pathogenesis process， and the expressions of these genes were time-dependent and sequential.
Keywords： tobacco; recombinant inbred lines population; bacterial wilt; dynamic QTL
烟草是一种重要的经济作物，在世界上多个国家均有种植。由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的烟草青枯病是烟草最严重的病害之一，该病的流行不仅导致烟草大面积减产，而且严重降低烟叶品质[1-2]。目前，烟草青枯病在我国的南方烟区频繁发生，且有向北方蔓延的趋势[1]。
烟草青枯病抗性属于受多基因控制的数量性状[3]，已有采用连锁作图的QTL定位方法解析青枯病抗病遗传的报道。如QIAN等[4]分别在TI448A×Enshu与TI448A×Yanyan97所构建的群体中进行与烟草青枯病抗性相关QTL的定位，分别在3号和5号连锁群上的不同区域定位到4个与烟草青枯病抗性相关的QTLs，解释抗性表型变异的9.00%～19.70%。LAN等[5]在以Yanyan97×红花大金元所构建的群体中定位到多个QTLs与青枯病抗性相关，其中位于17号连锁群上的qBWR17a最稳定，其贡献率达到了30.39%。袁清华等[3]利用大叶密合×长脖黄所构建的F2群体作材料，分别在第7、8、9、15、22号连锁群上定位到6个烟草青枯病抗性相关的QTLs，除位于22号连锁群的QTL以外贡献率均大于10%。另外，DRAKE STOWE等[6]探测到3个分别位于6、7、19号连锁群上的QTLs与烟草青枯病抗性相关。尽管这些结果有助于认识和了解烟草青枯病抗性的遗传特性，但遗憾的是这些研究均只涉及到青枯病病害发展的一个特定时期，检测到的QTL仅反映该特定时期抗病表型的累积效应，而难以反映病害多个发展时期之间的抗病表型，探测到的QTL信息不完全[7-8]。 为了探究性状在不同发育阶段中相关QTL动态表达情况，吴为人等[9]提出了动态QTL的概念与分析方法。该方法有效地利用了性状在不同发育阶段中的遗传信息，可提高QTL定位的灵敏度和准确性[10]。如赵芳明等[11]以水稻一个单片段代换系为材料，对水稻分蘖数进行动态分析，发现分蘖数QTL主要集中在某一两个生长时期内表达，具有明显的发育阶段特异性;亦有多位研究者相继对大豆亚麻酸含量[12]、玉米茎部蔗糖含量[13]、小麦株高和蛋白质含量[14-15]等多种作物不同性状进行了动态QTL的定位与分析，表明同一性状在不同发育阶段有不同的QTL参与表达。因此，在进行与数量性状相关的分子标记筛选时，应根据目的性状的特性在其不同发育时期所表达的QTL中进行选择，这样才能取得更加理想的效果[16]。遗憾的是烟草青枯病抗性动态QTL定位研究却鲜有报道。
本试验以大叶密合×长脖黄所构建的F6重组自交系（RIL）群体为研究材料，探测在烟草青枯病发病各个阶段的抗病QTL，并估算其效应大小;同时分析各阶段探测到的QTL是否相同，其表达是否具有一定时序性。研究结果旨在为烟草青枯病抗性遗传的研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 群体构建及抗性鉴定
通过单粒传代的方法，以晒烟品种大叶密合、烤烟品种长脖黄为亲本构建含有158个株系的F6代重组自交系（RIL）群体。其中长脖黄为易感青枯病品种，大叶密合为具有稳定高水平青枯病抗性的广东地方品种[17]。在本次试验中对重组自交系群体与父母本都进行了青枯病抗性评估。
1.2 田间试验
2015年12月和2016年12月连续两年在温室中播种亲本和重组自交系各株系材料，次年3月分别将幼苗移栽至广东省农科院白云试验基地试验田进行田间种植。采用顺序排列的方式进行田间移栽，父母本材料種植在中间，重复3次;试验田周围设立保护行，采用常规烟草栽培措施管理。在2016年5月初采取伤根法按每株150 mL（浓度为1×107cfu/mL）青枯病菌液进行青枯病菌的接种，2017年为田间自然发病。
1.3 抗性鉴定
连续两年进行亲本及RIL群体的病情调查，每年4次。2016年的4次调查期分别记为T1.1（5月26日）、T1.2（6月3日）、T1.3（6月11日）和T1.4（6月17日），2017年的4次调查期分别记为T2.1（5月10日）、T2.2（5月18日）、T2.3（5月26日）和T2.4（6月3日）。根据GB/T 23222—2008烟草病虫害分级及调查方法，以株为单位，按照病害程度分为0～9级。病情指数=∑（各级病株数×该病级值）/（调查总株数×最高级值）×100。利用SPSS、Excel对亲本与重组自交系群体（RIL）在各个调查期获得的病情指数进行统计与分析。
1.4 DNA提取与基因分型
在苗期采集烟草嫩叶，利用李荣华等[18]改进的CTAB法提取基因组DNA。用于本研究的分子标记包括从已公布的烟草SSR遗传图谱[19-21]中筛选出的1250个SSR标记，本实验室基于亲本RAD-seq数据所开发的200个SSR标记和300个InDel标记[22]。
通过检测亲本PCR产物筛选出具有多态性的标记，用于重组自交系（RIL）群体的基因分型。PCR反应体系为10 μL，其中包含30 ng/μL的DNA模板2 μL，10×PCR Buffer 1 μL，10 μmol/L的正反向引物各0.2 μL;10 mmol/L dNTPs 0.3 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.1 μL，dd H2O 6.2 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min，按94 ℃变性45 s、适宜退火温度（视引物而定）45 s和72 ℃延伸1 min 运行35个循环，72 ℃充分延伸10 min。PCR扩增产物采用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，按照郭培国等[23]改良的银染法显影检测。
1.5 遗传图谱的构建和QTL定位
采用JoinMap 4软件构建遗传图谱，设置LOD>3.0，错误检测水平为1%，使用Kosambi函数将重组率转换为图距单位（cM）。参照发布的烟草遗传图谱[19-21]中SSR标记所属连锁群对构建的连锁群进行编号。
利用WinQTLcart 2.5软件的复合区间作图法（CIM）定位各调查期存在的青枯病抗性QTL，QTL检测阈值采用重复抽样1000次的排布测验方法，显著水平设为0.05。
2 结 果
2.1 重组自交系群体的田间抗病性评价
两年的田间试验调查数据显示亲本间的青枯病抗性存在明显差异，大叶密合具较高的青枯病抗性、长脖黄易感青枯病（表1）。从表1中还可见到，亲本及株系接种后均表现出随着生长时间的延长病情指数不断增高现象，其中RIL群体的病情指数值变化范围较大，且病情指数值的偏态和峰度接近于零，近似于正态分布。不同调查期的F值均达到了极显著水平，表明在同一环境下试验群体中各株系的青枯病抗性存在显著差异。另外，RIL群体中存在一些株系其抗病性高于抗病亲本或低于感病性高于易感病亲本，表现出超亲现象。
两年田间试验RIL群体各调查时间的青枯病病情指数表现出显著的相关性（表2），其中相同年份不同调查时间的病情指数相关性均达到极显著水平，表明两年田间试验中各株系的青枯病抗性基本保持一致。
2.2 遗传连锁图谱构建
分析本研究初步筛选的1750个SSR和InDel标记在双亲间存在的多态性，发现641个SSR和95个InDel标记共736个标记在双亲间的PCR扩增条带清晰且具有多态性，利用这些标记对RIL群体进行基因分型。根据基因分型数据，运用JoinMap软件进行遗传作图，构建了一个含有546个SSR和80个InDel标记共626个标记的遗传图谱（图1）。该图谱总长度为2269.3 cM，包含24个连锁群;每个连锁群含有4～60个标记，长度从27.4 cM到191.9 cM不等，平均标记密度为3.63 cM/标记。 2.3 不同发病时期烟草青枯病抗性QTL的定位分析
对接种后烟草不同调查期的青枯病抗病性QTL进行了定位分析（表3）。在2016年T1.1～T1.4四个调查期中分别检测到4、4、6和4个与烟草抗病性相关的QTLs，它们分布于烟草的第2、6、8、16、18、21、22和23连锁群上，其表型变异解释率在5.03%～13.07%之间。这12个QTLs中有8个仅在一个调查期检测到，其余4个QTLs能在2～3个调查期中重复检测到;其中qBWR2a在T1.1、T1.4两个调查期被检测到，表型解释率分别为5.03%和8.51%;qBWR2d在T1.1、T1.2和T1.4被重复检测到，表型解释率介于6.10%～13.07%;qBWR23a在T1.1至T1.3三个时期被检测到，表型解释率介于9.65%～11.9%之间;qBWR23b在T1.1和T1.3两个时期被检测到，表型解释率分别为6.8%和8.87%。这些QTLs中有7个来自于抗性亲本大叶密合（加性效应为负），5个来自于易感亲本长脖黄（加性效应为正）。
在2017年的T2.1～T2.4四个调查期中分别检测到7、3、6和6个与烟草抗病性相关的QTLs，分布于烟草的第1、2、6、15、17、21、22和24连锁群上，其表型变异解释率在4.63%～18.18%之间。这17个QTLs中有3个QTLs被重复检测到，其中qBWR2b在2017年所有4个调查期中都被检测到，表型解释率介于6.56%～12.05%之间;qBWR15在T2.3和T2.4两个调查期被检测到，表型解释率分别为6.54%和5.86%;qBWR24a在T2.3和T2.4两个时期被检测到，表型解释率分别达到了5.18%和8.73%。这些QTLs中有10个来自于抗性亲本大叶密合，7个来于易感亲本长脖黄。两年8个调查期中共检测到28个QTLs，其中qBWR2d在两年不同的调查期中被重复检测到，其余6个重复出现的QTLs只出现在同一年的不同调查期中。
3 讨 论
标记之间的距离越小遗传图谱越饱和，QTL定位的结果越精确可靠[24]。InDel分子标记在基因组中分布和密度仅次于SNP分子标记，同时又具有变异稳定、多态性强、易检测等优点[25]。为了增加遗传图谱的饱和度，本研究在使用BINDLER等[19-20]等报道的SSR标记之外，同时结合了我们开发的InDel分子标记，构建了含有546个SSR标记和80个InDel标记的烟草遗传图谱，平均标记密度达到了3.63 cM/标记，密度高于近年来已发表的以二代分子标记为基础进行的烟草青枯病抗性相关的研究[3-6]，对比BINDLER等[20]发布的遗传图谱，绝大部分分子标记的分布与排序是一致的，有助于进一步的QTL定位分析。
通过两年烟草接种青枯病菌后不同时期开展的抗病动态QTL分析，共检测到28个QTLs，分布在基于BINDLER等[20]所构建遗传图谱的LG1、LG2、LG6、LG8、LG15、LG16、LG17、LG18、LG21、LG22、LG23和LG24等10个连锁群上，说明烟草青枯病抗性有多个基因参与，且抗病基因具有一个复杂的表达过程。与近年来基于该图谱连锁群编号进行的烟草青枯病抗性QTL研究的4篇报道相比，这些研究者亦在LG2[5]、LG6[5-6]、LG8[3]、LG15[3]、LG16[4]、LG17[5]、LG22[3]和LG24[5]上检测到与烟草青枯病抗性相关的QTLs，但这些研究未能在LG1、LG18、LG21和LG23检测到青枯病抗性QTL。而在早期开展的青枯病抗病研究中，NISHI等[26]在LG5上发现存在抗病相关的QTLs，但其遗传连锁群编号与BINDLER等[20]所构建遗传图谱的连锁群编号难以对应，究其原因是该研究构建遗传图谱所使用的标记为个性化明显的AFLP标记。杨友才等[27]通过试验发现一个与烟草青枯病抗性连锁的RAPD标记，但该标记缺少连锁群信息。令人感兴趣的是，本研究检测到的位于LG24上的qBWR24c的侧翼标记PT61494与LAN等[5]在该连锁群上检测到的qBWR24b的侧翼标记相同。还有，本研究在LG2上发现的2个QTLs（qBWR2b和qBWR2d），在整个发病过程中多次检测到，且在发病初期具有较大的贡献率，推断qBWR2b和qBWR2d在烟草抗病中可能扮演着较为重要的角色。此外，本研究使用了80个InDel标记，其中有12个为7个QTLs的侧翼标记，说明InDel标记可以有效的检测QTL[28]。
烟草青枯病抗性受多基因控制[3]，其QTL的表达易受环境的影响[5，29-30]。本研究连续两年开展的青枯病动态QTL定位发现在不同调查期检测到的QTL的数目与效应存在明显的差异，大多数QTLs只在特定调查期中出现，未发现在所有调查期中均能检测到的QTL，只有个别QTL可以在多个调查期中重复出现但其效应变化较大，此现象也在多个由多基因控制的动态QTL研究中出现[31-33]。这一结果表明控制某一性状的基因在不同环境下的表达具有一定的特异性和时序性，表现为在不同发育阶段有不同的基因发挥作用[10，16，24]。值得一提的是，本研究在两年的第一个调查期中都定位出多个贡献率大于10%的QTLs，可能是由于发病初期不同株系的抗病性存在差异，与抗性相关的基因表达最为活跃，类似的结果也出现在LI等[8]对马铃薯晚疫病抗性QTL动态的分析研究中。与只能反映某一环境特定调查期的传统QTL定位策略相比，本研究开展的青枯病抗病动态QTL分析可以较全面地了解参与烟草抗病过程中的基因，减少了传统QTL定位策略中遗漏遗传信息的情况，能够更加有效地解析烟草青枯病抗性基因。
4 结 论
本研究利用重組自交系通过连续两年对烟草发病后的4个不同时期进行抗性QTL的检测，结果共检测到分布于多个连锁群上的28个与青枯病抗性相关的QTLs。研究表明烟草在发病的不同阶段有不同的抗性基因发挥作用，抗性基因的表达具有时序性，该结果可为进一步解析烟草青枯病抗性机制提供参考。 参考文献
[1]孔凡玉. 烟草青枯病的综合防治[J]. 烟草科技，2003，50（4）：12-16.
KONG F Y. Integrated control of tobacco bacterial wilt disease[J]. Tobacco Science & Technology， 2003， 50（4）： 12-16.
[2]GILLHAM F， WARK D， HARRIGAN E. Disease resistant flue-cured tobacco breeding lines for north Queensland[J]. Australian Journal of Experimental Agriculture， 1977， 17（87）： 659-663.
[3]袁清华，马柱文，张振臣，等. 烟草品种大叶密合抗青枯病相关QTL的检测[J]. 中国烟草学报，2018，24（3）：77-81.
YUAN Q H， MA Z W， ZHANG Z C， et al. Detection of QTL associated with tobacco bacterial wilt resistance in cultivar Dayemihe[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2018， 24（3）： 77-81.
[4]QIAN Y L， WANG X S， WANG D Z， et al. The detection of QTLs controlling bacterial wilt resistance in tobacco （N. tabacum L.）[J]. Euphytica， 2013， 192（2）： 259-266.
[5]LAN T， ZHENG S P， YANG L， et al. Mapping of quantitative trait loci conferring resistance to bacterial wilt in tobacco （Nicotiana tabacum L.）[J]. Plant Breeding， 2015， 133（5）： 672-677.
[6]DRAKE-STOWE K， BAKAHER N， GOEPFERT S， et al. Multiple disease resistance loci affect soil-borne disease resistance in tobacco （Nicotiana tabacum L.）[J]. Phytopathology， 2017， 107（9）： 1055-1061.
[7]严建兵，汤华，黄益勤，等. 不同发育时期玉米株高QTL的动态分析[J]. 科学通报，2003，48（18）：1959-1964.
YAN J B， TANG H， HUANG Y Q， et al. QTL mapping for the developing of the plant height traits in maize[J]. Chinese Science Bulletin， 2003， 48（18）： 1959-1964.
[8]LI J C， LINDQVIST-KREUZE H， TIAN Z D， et al. Conditional QTL underlying resistance to late blight in a diploid potato population[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2012， 124（7）： 1339-1350.
[9]吴为人，李维明，卢浩然. 数量性状基因座的动态定位策略[J]. 生物数学学报，1997，12（5）：490-498.
WU W R， LI W M， LU H R. Strategy of dynamic mapping of quantitative trait loci[J]. Journal of Biomathematics， 1997， 12（5）： 490-498.
[10]朱占玲，刘宾，田宾，等. 小麦籽粒蛋白质含量的动态QTL定位[J]. 中国农业科学，2011，44（15）：3078-3085.
ZHU Z L， LIU B， TIAN B， et al. Dynamic QTL mapping of wheat protein content in developing grains[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2011， 44（15）： 3078-3085.
[11]趙芳明，刘桂富，朱海涛，等. 用单片段代换系对不同时期水稻分蘖数QTL的非条件和条件定位[J]. 中国农业科学，2008（2）：322-330.
ZHAO F M， LIU G F， ZHU H T， et al. Unconditional and conditional QTL mapping by using single segment substitution lines for tiller number at various stages in rice （Oryza sativa L.）[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2008（2）： 322-330.
[12]HAN Y P， XIE D W， TENG W L， et al. Dynamic QTL analysis of linolenic acid content in different developmental stages of soybean seed[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2011， 122（8）： 1481-1488. [13]BIAN Y L， GU X， SUN D L， et al. Mapping dynamic QTL of stalk sugar content at different growth stages in maize[J]. Euphytica， 2015， 205（1）： 85-94.
[14]WANG Z H， WU X S， REN Q， et al. QTL mapping for developmental behavior of plant height in wheat （Triticum aestivum L.）[J]. Euphytica， 2010， 174（3）： 447-458.
[15]LI H M， LIANG H， LI Z， et al. Dynamic QTL analysis of protein content and glutamine synthetase activity in recombinant inbred wheat lines[J]. Genetics and Molecular Research， 2015， 14（3）： 8706-8715.
[16]劉宾，赵亮，张坤普，等. 小麦株高发育动态QTL定位[J]. 中国农业科学，2010，43（22）：4562-4570.
LIU B， ZHAO L， ZHANG K P， et al. Genetic dissection of plant height at different growth stages in common wheat[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2010， 43（22）： 4562-4570.
[17]张振臣，邓海滨，刘琼光，等. 广东抗青枯病烟草资源筛选[J]. 广东农业科学，2014，41（7）：27-29.
ZHANG Z C， DENG H B， LIU Q G， et al. Screening of tobacco germplasm resistant to bacterial wilt in Guangdong[J]. Guangdong Agricultural Sciences， 2014， 41（7）： 27-29.
[18]李荣华，夏岩石，刘顺枝，等. 改进的CTAB提取植物DNA方法[J]. 实验室研究与探索，2009，28（9）：14-16.
LI R H， XIA Y S， LIU S Z， et al. CTAB-improved method of DNA extraction in plant[J]. Research and Exploration in Laboratory， 2009， 28（9）： 14-16.
[19]BINDLER G， HOEVEN V， GUNDUZ I， et al. A microsatellite marker based linkage map of tobacco[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2007， 114（2）： 341-349.
[20]BINDLER G， PLIESKE J， BAKAHER N， et al. A high density genetic map of tobacco （Nicotiana tabacum L.） obtained from large scale microsatellite marker development[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2011， 123（2）： 219-230.
[21]TONG Z J， YANG Z M， CHEN X J， et al. Large-scale development of microsatellite markers in Nicotiana tabacum and construction of a genetic map of flue-cured tobacco[J]. Plant Breeding， 2012， 131（5）： 674-680.
[22]李海洋，李荣华，夏岩石，等. 基于RAD-seq数据开发烟草多态性SSR标记[J]. 中国烟草科学，2018，39（1）：1-9.
LI H Y， LI R H， XIA R H， et al. Development of polymorphic SSR markers in tobacco based on RAD sequencing[J]. Chinese Tobacco Science， 2018， 39（1）： 1-9.
[23]郭培国，刘文杰，李海洋，等. 一种快速有效检测SSR标记的非变性聚丙烯酰胺凝胶的银染方法[J]. 广州大学学报（自然科学版），2016，15（4）：8-12.
GUO P G， LIU W J， LI H Y， et al. A rapid and effective method of silver staining for detecting SSR markers in nondenaturing polyacrylamide gels[J]. Journal of Guangzhou University（Natural Science Edition）， 2016，15（4）： 8-12.
[24]李美霞，沈玮囡，杨睿，等. 小麦籽粒干物质积累的动态QTL定位[J]. 西北植物学报，2014，34（6）：1105-1111. LI M X， SHEN W N， YANG R， et al. Dynamic QTL analysis for kernel dry matter accumulation in wheat[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica， 2014， 34（6）： 1105-1111.
[25]杨洁，赫佳，王丹碧，等. InDel标记的研究和应用进展[J]. 生物多样性，2016，24（2）：237-243.
YANG J， HAO J， WANG D B， et al. Progress in research and application of InDel markers[J]. Biodiversity Science， 2016， 24（2）： 237-243.
[26]NISHI T， TAJIMA T， NOGUCHI S， et al. Identification of DNA markers of tobacco linked to bacterial wilt resistance[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2003， 106（4）： 765-770.
[27]楊友才，周清明，朱列书. 烟草青枯病抗性基因的遗传分析及RAPD标记[J]. 中国烟草学报，2006，12（2）：38-42.
YANG Y C， ZHOU Q M， ZHU L S. Heredity and RAPD markers analysis of resistance gene to tobacco bacterial wil[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2006， 12（2）： 38-42.
[28]VASEM?GI A， GROSS R， PALM D， et al. Discovery and application of insertion-deletion （INDEL） polymorphisms for QTL mapping of early life-history traits in Atlantic salmon[J]. BMC Genomics， 2010， 11（1）： 1-11.
[29]赖瑞强，李荣华，夏岩石，等. 连锁与连锁不平衡联合作图解析烟草青枯病抗性遗传变异[J]. 中国烟草科学，2019，40（6）：1-10.
LAI R Q， LI R H， XIA Y S，et al. Dissection of genetic variations for tobacco bacterial wilt resistance based on joint linkage and linkage disequilibrium mapping[J]. Chinese Tobacco Science， 2019， 40（6）： 1-10.
[30]KATAWCZIK M， MILA A L. Plant age and strain of Ralstonia solanacearum affect the expression of resistance of tobacco cultivars to granville wilt[J]. Tobacco Science， 2012， 49： 8-13.
[31]ZHENG L N， ZHANG W W， CHEN X G， et al. Dynamic QTL analysis of rice protein content and protein index using recombinant inbred lines[J]. Journal of Plant Biology， 2011， 54（5）： 321-328.
[32]CHENG J P， WANG L， DU W L， et al. Dynamic quantitative trait locus analysis of seed dormancy at three development stages in rice[J]. Molecular Breeding， 2014， 34（2）： 501-510.
[33]SHANG L G， LIU F， WANG Y， et al. Dynamic QTL mapping for plant height in upland cotton （Gossypium hirsutum）[J]. Plant Breeding， 2015， 134（6）： 703-712.
关键词：烟草;RIL群体;青枯病;动态QTL
Abstract： In order to detect the QTLs controlling the dynamic change of tobacco bacterial wilt （TBW） resistance， 158 F6 recombinant inbred lines （RIL） derived from a cross between Dayemihe and Changbohuang were selected and genotyped with SSR and InDel markers， and a genetic map with 24 linkage groups was constructed by JoinMap 4 software. The map contained 546 SSR and 80 InDel markers and covered 2269.3 cM with a mean distance of 3.63 cM between adjacent markers. QTL mapping for TBW resistance was performed by WinQTLcart 2.5 software using the composite interval mapping （CIM） method based on TBW disease indexes at different survey time points in 2016 and 2017. 4， 4， 6 and 4 TBW resistance QTLs were detected at the four survey time points in 2016， respectively; the phenotypic variances of these QTLs ranged from 5.03% to 13.07%. At the four survey time points in 2017， 7， 3， 6 and 6 QTLs for TBW resistance were detected， respectively， and their phenotypic variances varied between 4.63% and 18.18%. A total of 28 QTLs were identified in two years， seven of them were detected repeatedly in different survey time points， but none could be found at all survey time points in both years. Moreover， the number and additive effect of TBW resistance QTLs had significant changes at four survey time points in both years. These results indicated that tobacco may utilize different TBW resistance genes at different stages during the pathogenesis process， and the expressions of these genes were time-dependent and sequential.
Keywords： tobacco; recombinant inbred lines population; bacterial wilt; dynamic QTL
烟草是一种重要的经济作物，在世界上多个国家均有种植。由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的烟草青枯病是烟草最严重的病害之一，该病的流行不仅导致烟草大面积减产，而且严重降低烟叶品质[1-2]。目前，烟草青枯病在我国的南方烟区频繁发生，且有向北方蔓延的趋势[1]。
烟草青枯病抗性属于受多基因控制的数量性状[3]，已有采用连锁作图的QTL定位方法解析青枯病抗病遗传的报道。如QIAN等[4]分别在TI448A×Enshu与TI448A×Yanyan97所构建的群体中进行与烟草青枯病抗性相关QTL的定位，分别在3号和5号连锁群上的不同区域定位到4个与烟草青枯病抗性相关的QTLs，解释抗性表型变异的9.00%～19.70%。LAN等[5]在以Yanyan97×红花大金元所构建的群体中定位到多个QTLs与青枯病抗性相关，其中位于17号连锁群上的qBWR17a最稳定，其贡献率达到了30.39%。袁清华等[3]利用大叶密合×长脖黄所构建的F2群体作材料，分别在第7、8、9、15、22号连锁群上定位到6个烟草青枯病抗性相关的QTLs，除位于22号连锁群的QTL以外贡献率均大于10%。另外，DRAKE STOWE等[6]探测到3个分别位于6、7、19号连锁群上的QTLs与烟草青枯病抗性相关。尽管这些结果有助于认识和了解烟草青枯病抗性的遗传特性，但遗憾的是这些研究均只涉及到青枯病病害发展的一个特定时期，检测到的QTL仅反映该特定时期抗病表型的累积效应，而难以反映病害多个发展时期之间的抗病表型，探测到的QTL信息不完全[7-8]。 为了探究性状在不同发育阶段中相关QTL动态表达情况，吴为人等[9]提出了动态QTL的概念与分析方法。该方法有效地利用了性状在不同发育阶段中的遗传信息，可提高QTL定位的灵敏度和准确性[10]。如赵芳明等[11]以水稻一个单片段代换系为材料，对水稻分蘖数进行动态分析，发现分蘖数QTL主要集中在某一两个生长时期内表达，具有明显的发育阶段特异性;亦有多位研究者相继对大豆亚麻酸含量[12]、玉米茎部蔗糖含量[13]、小麦株高和蛋白质含量[14-15]等多种作物不同性状进行了动态QTL的定位与分析，表明同一性状在不同发育阶段有不同的QTL参与表达。因此，在进行与数量性状相关的分子标记筛选时，应根据目的性状的特性在其不同发育时期所表达的QTL中进行选择，这样才能取得更加理想的效果[16]。遗憾的是烟草青枯病抗性动态QTL定位研究却鲜有报道。
本试验以大叶密合×长脖黄所构建的F6重组自交系（RIL）群体为研究材料，探测在烟草青枯病发病各个阶段的抗病QTL，并估算其效应大小;同时分析各阶段探测到的QTL是否相同，其表达是否具有一定时序性。研究结果旨在为烟草青枯病抗性遗传的研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 群体构建及抗性鉴定
通过单粒传代的方法，以晒烟品种大叶密合、烤烟品种长脖黄为亲本构建含有158个株系的F6代重组自交系（RIL）群体。其中长脖黄为易感青枯病品种，大叶密合为具有稳定高水平青枯病抗性的广东地方品种[17]。在本次试验中对重组自交系群体与父母本都进行了青枯病抗性评估。
1.2 田间试验
2015年12月和2016年12月连续两年在温室中播种亲本和重组自交系各株系材料，次年3月分别将幼苗移栽至广东省农科院白云试验基地试验田进行田间种植。采用顺序排列的方式进行田间移栽，父母本材料種植在中间，重复3次;试验田周围设立保护行，采用常规烟草栽培措施管理。在2016年5月初采取伤根法按每株150 mL（浓度为1×107cfu/mL）青枯病菌液进行青枯病菌的接种，2017年为田间自然发病。
1.3 抗性鉴定
连续两年进行亲本及RIL群体的病情调查，每年4次。2016年的4次调查期分别记为T1.1（5月26日）、T1.2（6月3日）、T1.3（6月11日）和T1.4（6月17日），2017年的4次调查期分别记为T2.1（5月10日）、T2.2（5月18日）、T2.3（5月26日）和T2.4（6月3日）。根据GB/T 23222—2008烟草病虫害分级及调查方法，以株为单位，按照病害程度分为0～9级。病情指数=∑（各级病株数×该病级值）/（调查总株数×最高级值）×100。利用SPSS、Excel对亲本与重组自交系群体（RIL）在各个调查期获得的病情指数进行统计与分析。
1.4 DNA提取与基因分型
在苗期采集烟草嫩叶，利用李荣华等[18]改进的CTAB法提取基因组DNA。用于本研究的分子标记包括从已公布的烟草SSR遗传图谱[19-21]中筛选出的1250个SSR标记，本实验室基于亲本RAD-seq数据所开发的200个SSR标记和300个InDel标记[22]。
通过检测亲本PCR产物筛选出具有多态性的标记，用于重组自交系（RIL）群体的基因分型。PCR反应体系为10 μL，其中包含30 ng/μL的DNA模板2 μL，10×PCR Buffer 1 μL，10 μmol/L的正反向引物各0.2 μL;10 mmol/L dNTPs 0.3 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.1 μL，dd H2O 6.2 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min，按94 ℃变性45 s、适宜退火温度（视引物而定）45 s和72 ℃延伸1 min 运行35个循环，72 ℃充分延伸10 min。PCR扩增产物采用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，按照郭培国等[23]改良的银染法显影检测。
1.5 遗传图谱的构建和QTL定位
采用JoinMap 4软件构建遗传图谱，设置LOD>3.0，错误检测水平为1%，使用Kosambi函数将重组率转换为图距单位（cM）。参照发布的烟草遗传图谱[19-21]中SSR标记所属连锁群对构建的连锁群进行编号。
利用WinQTLcart 2.5软件的复合区间作图法（CIM）定位各调查期存在的青枯病抗性QTL，QTL检测阈值采用重复抽样1000次的排布测验方法，显著水平设为0.05。
2 结 果
2.1 重组自交系群体的田间抗病性评价
两年的田间试验调查数据显示亲本间的青枯病抗性存在明显差异，大叶密合具较高的青枯病抗性、长脖黄易感青枯病（表1）。从表1中还可见到，亲本及株系接种后均表现出随着生长时间的延长病情指数不断增高现象，其中RIL群体的病情指数值变化范围较大，且病情指数值的偏态和峰度接近于零，近似于正态分布。不同调查期的F值均达到了极显著水平，表明在同一环境下试验群体中各株系的青枯病抗性存在显著差异。另外，RIL群体中存在一些株系其抗病性高于抗病亲本或低于感病性高于易感病亲本，表现出超亲现象。
两年田间试验RIL群体各调查时间的青枯病病情指数表现出显著的相关性（表2），其中相同年份不同调查时间的病情指数相关性均达到极显著水平，表明两年田间试验中各株系的青枯病抗性基本保持一致。
2.2 遗传连锁图谱构建
分析本研究初步筛选的1750个SSR和InDel标记在双亲间存在的多态性，发现641个SSR和95个InDel标记共736个标记在双亲间的PCR扩增条带清晰且具有多态性，利用这些标记对RIL群体进行基因分型。根据基因分型数据，运用JoinMap软件进行遗传作图，构建了一个含有546个SSR和80个InDel标记共626个标记的遗传图谱（图1）。该图谱总长度为2269.3 cM，包含24个连锁群;每个连锁群含有4～60个标记，长度从27.4 cM到191.9 cM不等，平均标记密度为3.63 cM/标记。 2.3 不同发病时期烟草青枯病抗性QTL的定位分析
对接种后烟草不同调查期的青枯病抗病性QTL进行了定位分析（表3）。在2016年T1.1～T1.4四个调查期中分别检测到4、4、6和4个与烟草抗病性相关的QTLs，它们分布于烟草的第2、6、8、16、18、21、22和23连锁群上，其表型变异解释率在5.03%～13.07%之间。这12个QTLs中有8个仅在一个调查期检测到，其余4个QTLs能在2～3个调查期中重复检测到;其中qBWR2a在T1.1、T1.4两个调查期被检测到，表型解释率分别为5.03%和8.51%;qBWR2d在T1.1、T1.2和T1.4被重复检测到，表型解释率介于6.10%～13.07%;qBWR23a在T1.1至T1.3三个时期被检测到，表型解释率介于9.65%～11.9%之间;qBWR23b在T1.1和T1.3两个时期被检测到，表型解释率分别为6.8%和8.87%。这些QTLs中有7个来自于抗性亲本大叶密合（加性效应为负），5个来自于易感亲本长脖黄（加性效应为正）。
在2017年的T2.1～T2.4四个调查期中分别检测到7、3、6和6个与烟草抗病性相关的QTLs，分布于烟草的第1、2、6、15、17、21、22和24连锁群上，其表型变异解释率在4.63%～18.18%之间。这17个QTLs中有3个QTLs被重复检测到，其中qBWR2b在2017年所有4个调查期中都被检测到，表型解释率介于6.56%～12.05%之间;qBWR15在T2.3和T2.4两个调查期被检测到，表型解释率分别为6.54%和5.86%;qBWR24a在T2.3和T2.4两个时期被检测到，表型解释率分别达到了5.18%和8.73%。这些QTLs中有10个来自于抗性亲本大叶密合，7个来于易感亲本长脖黄。两年8个调查期中共检测到28个QTLs，其中qBWR2d在两年不同的调查期中被重复检测到，其余6个重复出现的QTLs只出现在同一年的不同调查期中。
3 讨 论
标记之间的距离越小遗传图谱越饱和，QTL定位的结果越精确可靠[24]。InDel分子标记在基因组中分布和密度仅次于SNP分子标记，同时又具有变异稳定、多态性强、易检测等优点[25]。为了增加遗传图谱的饱和度，本研究在使用BINDLER等[19-20]等报道的SSR标记之外，同时结合了我们开发的InDel分子标记，构建了含有546个SSR标记和80个InDel标记的烟草遗传图谱，平均标记密度达到了3.63 cM/标记，密度高于近年来已发表的以二代分子标记为基础进行的烟草青枯病抗性相关的研究[3-6]，对比BINDLER等[20]发布的遗传图谱，绝大部分分子标记的分布与排序是一致的，有助于进一步的QTL定位分析。
通过两年烟草接种青枯病菌后不同时期开展的抗病动态QTL分析，共检测到28个QTLs，分布在基于BINDLER等[20]所构建遗传图谱的LG1、LG2、LG6、LG8、LG15、LG16、LG17、LG18、LG21、LG22、LG23和LG24等10个连锁群上，说明烟草青枯病抗性有多个基因参与，且抗病基因具有一个复杂的表达过程。与近年来基于该图谱连锁群编号进行的烟草青枯病抗性QTL研究的4篇报道相比，这些研究者亦在LG2[5]、LG6[5-6]、LG8[3]、LG15[3]、LG16[4]、LG17[5]、LG22[3]和LG24[5]上检测到与烟草青枯病抗性相关的QTLs，但这些研究未能在LG1、LG18、LG21和LG23检测到青枯病抗性QTL。而在早期开展的青枯病抗病研究中，NISHI等[26]在LG5上发现存在抗病相关的QTLs，但其遗传连锁群编号与BINDLER等[20]所构建遗传图谱的连锁群编号难以对应，究其原因是该研究构建遗传图谱所使用的标记为个性化明显的AFLP标记。杨友才等[27]通过试验发现一个与烟草青枯病抗性连锁的RAPD标记，但该标记缺少连锁群信息。令人感兴趣的是，本研究检测到的位于LG24上的qBWR24c的侧翼标记PT61494与LAN等[5]在该连锁群上检测到的qBWR24b的侧翼标记相同。还有，本研究在LG2上发现的2个QTLs（qBWR2b和qBWR2d），在整个发病过程中多次检测到，且在发病初期具有较大的贡献率，推断qBWR2b和qBWR2d在烟草抗病中可能扮演着较为重要的角色。此外，本研究使用了80个InDel标记，其中有12个为7个QTLs的侧翼标记，说明InDel标记可以有效的检测QTL[28]。
烟草青枯病抗性受多基因控制[3]，其QTL的表达易受环境的影响[5，29-30]。本研究连续两年开展的青枯病动态QTL定位发现在不同调查期检测到的QTL的数目与效应存在明显的差异，大多数QTLs只在特定调查期中出现，未发现在所有调查期中均能检测到的QTL，只有个别QTL可以在多个调查期中重复出现但其效应变化较大，此现象也在多个由多基因控制的动态QTL研究中出现[31-33]。这一结果表明控制某一性状的基因在不同环境下的表达具有一定的特异性和时序性，表现为在不同发育阶段有不同的基因发挥作用[10，16，24]。值得一提的是，本研究在两年的第一个调查期中都定位出多个贡献率大于10%的QTLs，可能是由于发病初期不同株系的抗病性存在差异，与抗性相关的基因表达最为活跃，类似的结果也出现在LI等[8]对马铃薯晚疫病抗性QTL动态的分析研究中。与只能反映某一环境特定调查期的传统QTL定位策略相比，本研究开展的青枯病抗病动态QTL分析可以较全面地了解参与烟草抗病过程中的基因，减少了传统QTL定位策略中遗漏遗传信息的情况，能够更加有效地解析烟草青枯病抗性基因。
4 结 论
本研究利用重組自交系通过连续两年对烟草发病后的4个不同时期进行抗性QTL的检测，结果共检测到分布于多个连锁群上的28个与青枯病抗性相关的QTLs。研究表明烟草在发病的不同阶段有不同的抗性基因发挥作用，抗性基因的表达具有时序性，该结果可为进一步解析烟草青枯病抗性机制提供参考。 参考文献
[1]孔凡玉. 烟草青枯病的综合防治[J]. 烟草科技，2003，50（4）：12-16.
KONG F Y. Integrated control of tobacco bacterial wilt disease[J]. Tobacco Science & Technology， 2003， 50（4）： 12-16.
[2]GILLHAM F， WARK D， HARRIGAN E. Disease resistant flue-cured tobacco breeding lines for north Queensland[J]. Australian Journal of Experimental Agriculture， 1977， 17（87）： 659-663.
[3]袁清华，马柱文，张振臣，等. 烟草品种大叶密合抗青枯病相关QTL的检测[J]. 中国烟草学报，2018，24（3）：77-81.
YUAN Q H， MA Z W， ZHANG Z C， et al. Detection of QTL associated with tobacco bacterial wilt resistance in cultivar Dayemihe[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2018， 24（3）： 77-81.
[4]QIAN Y L， WANG X S， WANG D Z， et al. The detection of QTLs controlling bacterial wilt resistance in tobacco （N. tabacum L.）[J]. Euphytica， 2013， 192（2）： 259-266.
[5]LAN T， ZHENG S P， YANG L， et al. Mapping of quantitative trait loci conferring resistance to bacterial wilt in tobacco （Nicotiana tabacum L.）[J]. Plant Breeding， 2015， 133（5）： 672-677.
[6]DRAKE-STOWE K， BAKAHER N， GOEPFERT S， et al. Multiple disease resistance loci affect soil-borne disease resistance in tobacco （Nicotiana tabacum L.）[J]. Phytopathology， 2017， 107（9）： 1055-1061.
[7]严建兵，汤华，黄益勤，等. 不同发育时期玉米株高QTL的动态分析[J]. 科学通报，2003，48（18）：1959-1964.
YAN J B， TANG H， HUANG Y Q， et al. QTL mapping for the developing of the plant height traits in maize[J]. Chinese Science Bulletin， 2003， 48（18）： 1959-1964.
[8]LI J C， LINDQVIST-KREUZE H， TIAN Z D， et al. Conditional QTL underlying resistance to late blight in a diploid potato population[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2012， 124（7）： 1339-1350.
[9]吴为人，李维明，卢浩然. 数量性状基因座的动态定位策略[J]. 生物数学学报，1997，12（5）：490-498.
WU W R， LI W M， LU H R. Strategy of dynamic mapping of quantitative trait loci[J]. Journal of Biomathematics， 1997， 12（5）： 490-498.
[10]朱占玲，刘宾，田宾，等. 小麦籽粒蛋白质含量的动态QTL定位[J]. 中国农业科学，2011，44（15）：3078-3085.
ZHU Z L， LIU B， TIAN B， et al. Dynamic QTL mapping of wheat protein content in developing grains[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2011， 44（15）： 3078-3085.
[11]趙芳明，刘桂富，朱海涛，等. 用单片段代换系对不同时期水稻分蘖数QTL的非条件和条件定位[J]. 中国农业科学，2008（2）：322-330.
ZHAO F M， LIU G F， ZHU H T， et al. Unconditional and conditional QTL mapping by using single segment substitution lines for tiller number at various stages in rice （Oryza sativa L.）[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2008（2）： 322-330.
[12]HAN Y P， XIE D W， TENG W L， et al. Dynamic QTL analysis of linolenic acid content in different developmental stages of soybean seed[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2011， 122（8）： 1481-1488. [13]BIAN Y L， GU X， SUN D L， et al. Mapping dynamic QTL of stalk sugar content at different growth stages in maize[J]. Euphytica， 2015， 205（1）： 85-94.
[14]WANG Z H， WU X S， REN Q， et al. QTL mapping for developmental behavior of plant height in wheat （Triticum aestivum L.）[J]. Euphytica， 2010， 174（3）： 447-458.
[15]LI H M， LIANG H， LI Z， et al. Dynamic QTL analysis of protein content and glutamine synthetase activity in recombinant inbred wheat lines[J]. Genetics and Molecular Research， 2015， 14（3）： 8706-8715.
[16]劉宾，赵亮，张坤普，等. 小麦株高发育动态QTL定位[J]. 中国农业科学，2010，43（22）：4562-4570.
LIU B， ZHAO L， ZHANG K P， et al. Genetic dissection of plant height at different growth stages in common wheat[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2010， 43（22）： 4562-4570.
[17]张振臣，邓海滨，刘琼光，等. 广东抗青枯病烟草资源筛选[J]. 广东农业科学，2014，41（7）：27-29.
ZHANG Z C， DENG H B， LIU Q G， et al. Screening of tobacco germplasm resistant to bacterial wilt in Guangdong[J]. Guangdong Agricultural Sciences， 2014， 41（7）： 27-29.
[18]李荣华，夏岩石，刘顺枝，等. 改进的CTAB提取植物DNA方法[J]. 实验室研究与探索，2009，28（9）：14-16.
LI R H， XIA Y S， LIU S Z， et al. CTAB-improved method of DNA extraction in plant[J]. Research and Exploration in Laboratory， 2009， 28（9）： 14-16.
[19]BINDLER G， HOEVEN V， GUNDUZ I， et al. A microsatellite marker based linkage map of tobacco[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2007， 114（2）： 341-349.
[20]BINDLER G， PLIESKE J， BAKAHER N， et al. A high density genetic map of tobacco （Nicotiana tabacum L.） obtained from large scale microsatellite marker development[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2011， 123（2）： 219-230.
[21]TONG Z J， YANG Z M， CHEN X J， et al. Large-scale development of microsatellite markers in Nicotiana tabacum and construction of a genetic map of flue-cured tobacco[J]. Plant Breeding， 2012， 131（5）： 674-680.
[22]李海洋，李荣华，夏岩石，等. 基于RAD-seq数据开发烟草多态性SSR标记[J]. 中国烟草科学，2018，39（1）：1-9.
LI H Y， LI R H， XIA R H， et al. Development of polymorphic SSR markers in tobacco based on RAD sequencing[J]. Chinese Tobacco Science， 2018， 39（1）： 1-9.
[23]郭培国，刘文杰，李海洋，等. 一种快速有效检测SSR标记的非变性聚丙烯酰胺凝胶的银染方法[J]. 广州大学学报（自然科学版），2016，15（4）：8-12.
GUO P G， LIU W J， LI H Y， et al. A rapid and effective method of silver staining for detecting SSR markers in nondenaturing polyacrylamide gels[J]. Journal of Guangzhou University（Natural Science Edition）， 2016，15（4）： 8-12.
[24]李美霞，沈玮囡，杨睿，等. 小麦籽粒干物质积累的动态QTL定位[J]. 西北植物学报，2014，34（6）：1105-1111. LI M X， SHEN W N， YANG R， et al. Dynamic QTL analysis for kernel dry matter accumulation in wheat[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica， 2014， 34（6）： 1105-1111.
[25]杨洁，赫佳，王丹碧，等. InDel标记的研究和应用进展[J]. 生物多样性，2016，24（2）：237-243.
YANG J， HAO J， WANG D B， et al. Progress in research and application of InDel markers[J]. Biodiversity Science， 2016， 24（2）： 237-243.
[26]NISHI T， TAJIMA T， NOGUCHI S， et al. Identification of DNA markers of tobacco linked to bacterial wilt resistance[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2003， 106（4）： 765-770.
[27]楊友才，周清明，朱列书. 烟草青枯病抗性基因的遗传分析及RAPD标记[J]. 中国烟草学报，2006，12（2）：38-42.
YANG Y C， ZHOU Q M， ZHU L S. Heredity and RAPD markers analysis of resistance gene to tobacco bacterial wil[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2006， 12（2）： 38-42.
[28]VASEM?GI A， GROSS R， PALM D， et al. Discovery and application of insertion-deletion （INDEL） polymorphisms for QTL mapping of early life-history traits in Atlantic salmon[J]. BMC Genomics， 2010， 11（1）： 1-11.
[29]赖瑞强，李荣华，夏岩石，等. 连锁与连锁不平衡联合作图解析烟草青枯病抗性遗传变异[J]. 中国烟草科学，2019，40（6）：1-10.
LAI R Q， LI R H， XIA Y S，et al. Dissection of genetic variations for tobacco bacterial wilt resistance based on joint linkage and linkage disequilibrium mapping[J]. Chinese Tobacco Science， 2019， 40（6）： 1-10.
[30]KATAWCZIK M， MILA A L. Plant age and strain of Ralstonia solanacearum affect the expression of resistance of tobacco cultivars to granville wilt[J]. Tobacco Science， 2012， 49： 8-13.
[31]ZHENG L N， ZHANG W W， CHEN X G， et al. Dynamic QTL analysis of rice protein content and protein index using recombinant inbred lines[J]. Journal of Plant Biology， 2011， 54（5）： 321-328.
[32]CHENG J P， WANG L， DU W L， et al. Dynamic quantitative trait locus analysis of seed dormancy at three development stages in rice[J]. Molecular Breeding， 2014， 34（2）： 501-510.
[33]SHANG L G， LIU F， WANG Y， et al. Dynamic QTL mapping for plant height in upland cotton （Gossypium hirsutum）[J]. Plant Breeding， 2015， 134（6）： 703-712.