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菊花容易受到病毒感染而造成品质下降,目前国内对菊花病毒的检测主要根据外观表现或者定性PCR检测,无法准确判定病毒载量.为构建一种可同时用于检测菊花B病毒(Chrysanthemum virus B,CVB)、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus,TAV)和菊花褪绿斑驳类病毒(Chrysanthemum chloritic mottle viroid,CChMVd)的实时荧光定量RT-PCR检测方法,本研究分别以保守区域作为靶标设计相应的引物探针,通过优化扩增体系中CVB、TAV、CChMVd 3种病毒/类病毒探针浓度、引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度,摸索扩增程序中反转录时间、退火温度和扩增循环数,构建了一种可同时用于CVB、TAV、CChMVd的3重实时荧光定量RT-PCR检测体系,优化后的扩扩增体系中CVB、TAV和CChMVd的探针浓度分别为100 nmol/L、120 nmol/L和80 nmol/L,引物浓度分别为200 nmol/L、240 nmol/L和160 nmol/L,Mg2+浓度为3.0 mmol/L;dNTPs浓度200 μmol/L;最适反转录时间为25 min,退火温度为60℃,循环数为40.敏感性实验结果表明,该反应体系对3种病毒/类病毒的敏感性为1.0× 103拷贝/mL,敏感性好;定量线性范围为1.0×103拷贝/mL～1.0×1010拷贝/mL,线性范围宽;特异性好,对菊花矮化类病毒、烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒核酸检测结果为阴性;对1.0×104拷贝/mL的低浓度参考品平行检测10次,定量结果lg值偏差(CV％)为4.81％,重复性好.在南京农业大学“中国菊花种质资源保存中心”基地随机选择菊花20株进行本研究试剂检测,检出6例CVB病毒株和4例TAV病毒株,其病毒载量为2.5× 104拷贝/mL～5.5× 107拷贝/mL,随机选择1株CVB病毒株定量PCR,产物进行TA克隆后经测序与NCBI Blast比对,其与MH678704.1的同源性为100％.因此,本研究建立了一种能同时检测CVB、TAV、CChMVd3种菊花常见病毒/类病毒的灵敏、快速、可定量的检测方法.