【摘 要】
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目的 构建大鼠β防御素2(rBD2)基因RNAi慢病毒重组载体,转染培养细胞,检测其沉默效应,筛选出最佳的RNAi慢病毒载体.方法 序列软件设计3条针对rBD2基因CDS区的siRNA序列,合成单链后退火形成双链DNA,分别与酶切处理的慢病毒载体lentivirus连接构成3个RNAi慢病毒重组载体,再转化细菌,测序鉴定.脂质体法转染细胞,荧光实时定量PCR(RT-PCR)及Western免疫印迹
【机 构】
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200120,上海,同济大学医学院附属东方医院呼吸科,上海杨浦区中心医院肾内科,200120,上海,同济大学医学院附属东方医院呼吸科,200120,上海,同济大学医学院附属东方医院呼吸科
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目的 构建大鼠β防御素2(rBD2)基因RNAi慢病毒重组载体,转染培养细胞,检测其沉默效应,筛选出最佳的RNAi慢病毒载体.方法 序列软件设计3条针对rBD2基因CDS区的siRNA序列,合成单链后退火形成双链DNA,分别与酶切处理的慢病毒载体lentivirus连接构成3个RNAi慢病毒重组载体,再转化细菌,测序鉴定.脂质体法转染细胞,荧光实时定量PCR(RT-PCR)及Western免疫印迹测rBD-2 mRNA及蛋白表达,筛选沉默效果最佳的为LV-shrBD2载体.用慢病毒包装系统对LV-shrBD2进行慢病毒颗粒包装并梯度稀释法测定病毒滴度.结果 凝胶电泳显示3个RNAi慢病毒重组载体的PCR产物为316 bp,测序结果表明序列正确.转染细胞后RT-PCR及Western免疫印迹检测,siRNA序列1构建的重组载体mRNA抑制率达82%,干扰效率最高,为所需的rBD2基因RNAi慢病毒载体LV-shrBD2.包装慢病毒颗粒并调整病毒滴度至1×105ifu/μl.结论 成功构建并筛选出沉默效应最佳的rBD2基因RNAi慢病毒表达载体LV-sh1rBD2,为进一步开展rBD2研究提供了依据。
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