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[摘要] 目的 评价多重PCR在快速诊断社区获得性肺炎病原体中的作用。方法 提取痰液标本中的DNA，扩增病原体DNA后电泳并观察其结果，同时给予普通PCR或分离培养作为对照。结果 成功检测出32例感染者，与普通PCR符合率达100%，敏感性高于分离培养。结论 多重PCR能高通量、快速诊断病原体，值得临床进一步推廣。
[关键词] 多重PCR；社区获得性肺炎；病原体
[中图分类号] R563.1 [文献标识码] A[文章编号] 1673-9701（2009）12-57-02
Detection of Pathogens in Patients with Community-acquired Pneumonia by Multiplex PCR
HE XinpingLIUJingfangTAN Huimin
Department of the Elderly Officials，Changsha Central Hospital， Changsha 410007
[Abstract] Objective To observe the rapid diagnosis value of multiplex PCR in patients with community-acquired pneumonia. Methods DNA was extracted and amplified from sputum. Common PCR or separation cullture was used as control. Results Pathogens were amplified from 32 patients，compared with common PCR，the coincidence was 100%，but the sensitivity was higher than separation cullture. Conclusion Multiplex PCR is a high-flux，repid method for clinical diagnosis of pathogens.
[Key Words] Multiplex PCR； Community-acquired pneumonia； Pathogen
社区获得性肺炎（Community-acquired pneumonia，CAP）是指在医院外罹患的感染性肺实质（含肺泡壁，即广义上的肺间质）炎症，包括具有明确潜伏期的病原体感染而在入院后潜伏期内发病的肺炎[1]。传统的病原学诊断包括分离培养以及PCR。然而对于部分难以培养的病原体如肺炎支原体，常规的方法难以达到快速诊断的目的，普通PCR也存在监测通量低等问题[2]。本文采用多重PCR（multiplex PCR）就2006～2008年来我院住院的CAP患者进行了相应比较研究，旨在对多重PCR的临床应用作出初步评价。
1材料与方法
1.1材料
Tag酶，dNTPs，PCR缓冲液，引物合成等均来自上海生物工程有限公司；DNA抽提试剂盒购自QiaGen公司；PCR仪为德国Eppendorf公司产品；普通肉汤葡萄糖培养基、血琼脂培养基购自上海美季生物技术有限公司。其余所有生化试剂均为分析纯。
1.2病例选择及标本来源
本研究所采用的76例痰标本均来自本院住院的CAP患者，所有患者肺部感染的符合中华医学会2006年制定的《社区获得性肺炎诊断和治疗指南》标准[3]，其中男性44例，女性32例，年龄41～74岁，平均52.5岁。痰标本分别来自上述76例患者，均为清晨清洁口腔后的一口来自肺深部的痰，所有患者取材前2w内均未接受抗菌药物治疗。
1.3方法
1）检测肺炎球菌、肺炎衣原体、肺炎支原体和流感嗜血杆菌的多重PCR引物信息见表1[4]。20μl反应体系中加入标本DNA 2μL，扩增方案为：94℃变性10min，然后94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 1min，共40循环。最后一循环，72℃延伸7min。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析。所有病原体同时通过普通PCR做对照。判断标准：扩增产物条带电泳位置与Marker电泳位置相同者为该菌阳性。2）细菌培养：痰标本经常规处理后接种于普通培养基和琼脂培养基上，37℃孵育24～48h行革兰染色及有关生化反应鉴定。
2结果
2.1 多重PCR与普通PCR检测结果
多重PCR与普通PCR检测结果完全一致。痰标本同时进行多重PCR和普通PCR检测，两者均检测出肺炎球菌14例，肺炎衣原体2例，肺炎支原体5例，流感嗜血杆菌11例，其中有25份标本为以上4种菌的混合感染。多重PCR与普通PCR的符合率达100%。
2.2多重PCR与细菌培养结果比较
76份标本中经细菌培养法分离出肺炎球菌11例，流感嗜血杆菌8例。其分离的敏感性略低于多重PCR法。多重PCR检测以上4种菌阴性的44例患者中无一例培养阳性。
3讨论
CAP是威胁人类健康的常见感染性疾病之一，病原学往往十分复杂，通常为混合感染。因此，精确的病原学诊断不仅是确诊的重要依据，也是合理选择治疗方案的基础。目前病原学检查主要以培养为主，但通常需要耗时达3d左右，而且操作繁琐，影响因素多。相对而言，分子生物学技术如PCR，在时耗、敏感性及特异性方面均具有分离培养无法比拟的优势，但面对众多复杂的病原微生物，检测通量一直是其瓶颈[2]。多重PCR技术反应原理，反应试剂和操作过程与普通PCR相同。由于能在同一反应试管内同时检出多种病原体，大大节省了时间和经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。
本研究结果发现，多重PCR方法能在与普通PCR几乎相同的时间内检测出4种病原体，其检测的所有的阴性患者中，通过普通培养或PCR法加以对照后显示，其假阳性率为0’其敏感性和特异性均与普通PCR相同，因此该方法非常适合混合感染（如CAP）的病原学诊断，因而更具有广阔的临床应用前景。与传统的分离培养相比，敏感性更高，对于难以培养的肺炎衣原体、肺炎支原体，其优势更加明显[5]。
尽管如此，但多重PCR也具有普通PCR一样的缺陷，如假阳性、假阴性问题，以及不同的DNA提取方法可能反应结果有所不同[6]。因此临床医师在下结论是应该慎重。另外，多重PCR的费用问题也在很大程度上限制了其广泛应用，但考虑到其具有其他方法无可比拟的优势[7，8]，笔者认为将其应用于临床并非梦想。
[参考文献]
[1] 何礼贤. 社区获得性肺炎的诊治进展[J]. 临床肺科杂志，2005，10（1）：2.
[2] Morozumi M，Hasegawa K，Chiba N，et al. Application of PCR for Mycoplasma pneumoniae detection in children with community-acquired pneumonia[J]. J Infect Chemother，2004，10（5）：274-279.
[3] 中华医学会呼吸病学分会. 社区获得性肺炎诊断和治疗指南（2006年修订版）[J]. 中华结核和呼吸杂志，2006，29（10）：651-655.
[4] 吴移谋. 支原体学[M]. 北京：人民卫生出版社，2008：138.
[5] Greco G，Corrente M，Martella V，et al. A multiplex-PCR for the diagnosis of contagious agalactia of sheep and goats[J]. Mol Cell Probes，2001，15（1）：21-25.
[6] Loens K，Ursi D，Goossens H，et al. Molecular diagnosis of Mycoplasma pneumoniae respiratory tract infections[J]. J Clin Microbiol， 2003， 41（11）：4915-4923.
[7] Deng J，Zheng Y，Zhao R，et al. Culture versus polymerase chain reaction for the etiologic diagnosis of community-acquired pneumonia in antibiotic-pretreated pediatric patients[J]. Pediatr Infect Dis J，2009，28（1）：53- 55.
[8] Pinar A，Bozdemir N，Kocagz T，et al. Rapid detection of bacterial atypical pneumonia agents by multiplex PCR[J]. Cent Eur J Public Health，2004， 12（1）：3-5.
（收稿日期：2008-12-24）
[关键词] 多重PCR；社区获得性肺炎；病原体
[中图分类号] R563.1 [文献标识码] A[文章编号] 1673-9701（2009）12-57-02
Detection of Pathogens in Patients with Community-acquired Pneumonia by Multiplex PCR
HE XinpingLIUJingfangTAN Huimin
Department of the Elderly Officials，Changsha Central Hospital， Changsha 410007
[Abstract] Objective To observe the rapid diagnosis value of multiplex PCR in patients with community-acquired pneumonia. Methods DNA was extracted and amplified from sputum. Common PCR or separation cullture was used as control. Results Pathogens were amplified from 32 patients，compared with common PCR，the coincidence was 100%，but the sensitivity was higher than separation cullture. Conclusion Multiplex PCR is a high-flux，repid method for clinical diagnosis of pathogens.
[Key Words] Multiplex PCR； Community-acquired pneumonia； Pathogen
社区获得性肺炎（Community-acquired pneumonia，CAP）是指在医院外罹患的感染性肺实质（含肺泡壁，即广义上的肺间质）炎症，包括具有明确潜伏期的病原体感染而在入院后潜伏期内发病的肺炎[1]。传统的病原学诊断包括分离培养以及PCR。然而对于部分难以培养的病原体如肺炎支原体，常规的方法难以达到快速诊断的目的，普通PCR也存在监测通量低等问题[2]。本文采用多重PCR（multiplex PCR）就2006～2008年来我院住院的CAP患者进行了相应比较研究，旨在对多重PCR的临床应用作出初步评价。
1材料与方法
1.1材料
Tag酶，dNTPs，PCR缓冲液，引物合成等均来自上海生物工程有限公司；DNA抽提试剂盒购自QiaGen公司；PCR仪为德国Eppendorf公司产品；普通肉汤葡萄糖培养基、血琼脂培养基购自上海美季生物技术有限公司。其余所有生化试剂均为分析纯。
1.2病例选择及标本来源
本研究所采用的76例痰标本均来自本院住院的CAP患者，所有患者肺部感染的符合中华医学会2006年制定的《社区获得性肺炎诊断和治疗指南》标准[3]，其中男性44例，女性32例，年龄41～74岁，平均52.5岁。痰标本分别来自上述76例患者，均为清晨清洁口腔后的一口来自肺深部的痰，所有患者取材前2w内均未接受抗菌药物治疗。
1.3方法
1）检测肺炎球菌、肺炎衣原体、肺炎支原体和流感嗜血杆菌的多重PCR引物信息见表1[4]。20μl反应体系中加入标本DNA 2μL，扩增方案为：94℃变性10min，然后94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 1min，共40循环。最后一循环，72℃延伸7min。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析。所有病原体同时通过普通PCR做对照。判断标准：扩增产物条带电泳位置与Marker电泳位置相同者为该菌阳性。2）细菌培养：痰标本经常规处理后接种于普通培养基和琼脂培养基上，37℃孵育24～48h行革兰染色及有关生化反应鉴定。
2结果
2.1 多重PCR与普通PCR检测结果
多重PCR与普通PCR检测结果完全一致。痰标本同时进行多重PCR和普通PCR检测，两者均检测出肺炎球菌14例，肺炎衣原体2例，肺炎支原体5例，流感嗜血杆菌11例，其中有25份标本为以上4种菌的混合感染。多重PCR与普通PCR的符合率达100%。
2.2多重PCR与细菌培养结果比较
76份标本中经细菌培养法分离出肺炎球菌11例，流感嗜血杆菌8例。其分离的敏感性略低于多重PCR法。多重PCR检测以上4种菌阴性的44例患者中无一例培养阳性。
3讨论
CAP是威胁人类健康的常见感染性疾病之一，病原学往往十分复杂，通常为混合感染。因此，精确的病原学诊断不仅是确诊的重要依据，也是合理选择治疗方案的基础。目前病原学检查主要以培养为主，但通常需要耗时达3d左右，而且操作繁琐，影响因素多。相对而言，分子生物学技术如PCR，在时耗、敏感性及特异性方面均具有分离培养无法比拟的优势，但面对众多复杂的病原微生物，检测通量一直是其瓶颈[2]。多重PCR技术反应原理，反应试剂和操作过程与普通PCR相同。由于能在同一反应试管内同时检出多种病原体，大大节省了时间和经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。
本研究结果发现，多重PCR方法能在与普通PCR几乎相同的时间内检测出4种病原体，其检测的所有的阴性患者中，通过普通培养或PCR法加以对照后显示，其假阳性率为0’其敏感性和特异性均与普通PCR相同，因此该方法非常适合混合感染（如CAP）的病原学诊断，因而更具有广阔的临床应用前景。与传统的分离培养相比，敏感性更高，对于难以培养的肺炎衣原体、肺炎支原体，其优势更加明显[5]。
尽管如此，但多重PCR也具有普通PCR一样的缺陷，如假阳性、假阴性问题，以及不同的DNA提取方法可能反应结果有所不同[6]。因此临床医师在下结论是应该慎重。另外，多重PCR的费用问题也在很大程度上限制了其广泛应用，但考虑到其具有其他方法无可比拟的优势[7，8]，笔者认为将其应用于临床并非梦想。
[参考文献]
[1] 何礼贤. 社区获得性肺炎的诊治进展[J]. 临床肺科杂志，2005，10（1）：2.
[2] Morozumi M，Hasegawa K，Chiba N，et al. Application of PCR for Mycoplasma pneumoniae detection in children with community-acquired pneumonia[J]. J Infect Chemother，2004，10（5）：274-279.
[3] 中华医学会呼吸病学分会. 社区获得性肺炎诊断和治疗指南（2006年修订版）[J]. 中华结核和呼吸杂志，2006，29（10）：651-655.
[4] 吴移谋. 支原体学[M]. 北京：人民卫生出版社，2008：138.
[5] Greco G，Corrente M，Martella V，et al. A multiplex-PCR for the diagnosis of contagious agalactia of sheep and goats[J]. Mol Cell Probes，2001，15（1）：21-25.
[6] Loens K，Ursi D，Goossens H，et al. Molecular diagnosis of Mycoplasma pneumoniae respiratory tract infections[J]. J Clin Microbiol， 2003， 41（11）：4915-4923.
[7] Deng J，Zheng Y，Zhao R，et al. Culture versus polymerase chain reaction for the etiologic diagnosis of community-acquired pneumonia in antibiotic-pretreated pediatric patients[J]. Pediatr Infect Dis J，2009，28（1）：53- 55.
[8] Pinar A，Bozdemir N，Kocagz T，et al. Rapid detection of bacterial atypical pneumonia agents by multiplex PCR[J]. Cent Eur J Public Health，2004， 12（1）：3-5.
（收稿日期：2008-12-24）