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摘要[目的]评价阿育魏实总黄酮的抗氧化能力。[方法]采用羟自由基、超氧阴离子自由基、亚硝基自由基、DPPH自由基、ABTS自由基体系对阿育魏实总黄酮抗氧化的能力进行研究。 [结果]在质量浓度0.025～0.500 mg/ml的范围内，阿育魏实总黄酮对羟自由基、超氧阴离子自由基、亚硝基自由基、DPPH自由基、ABTS自由基的清除率分别为31.68%～99.01%、27.45%～90.52%、11.62%～86.40%、41.31%～92.21%和17.53%～62.67%，且存在明显的量效关系。IC50分别为 0.038 49、0.053 51、0.271 60、0.026 17和0.033 87 mg/ml。[结论]阿育魏实总黄酮具有很好的体外抗氧化活性，是一种新型天然抗氧化物质来源。
关键词 阿育魏实；总黄酮；自由基；抗氧化活性
中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2014）15-04624-02
Abstract[Objective] To evaluate antioxidant capacity of total flavonoids of Trachyspermum ammi （L.） Sparuge. [Methods] Using hydroxyl free radicals， superoxide anion free radicals， nitroso free radicals， DPPH free radicals， and ABTS free radical system on total flavonoids of Trachyspermum ammi （L.） Sparuge. [Results] In the mass concentration within the range of 0.025-0.5 mg/ml， its ability to remove the free radicals was 31.68%-99.01%， 27.45%-90.52%， 11.62%-86.40%， 41.31%-92.21%， and 17.53%-62.67%， and there was significant dose-response relationship. IC50 was 0.038 49 mg/ml， 0.03849 mg/ml， 0.03849 mg/ml， 0.053 51 mg/ml， and 0.033 87 mg/ml respectively. [Conclusion] Total flavonoids of Trachyspermum ammi （L.） Sparuge has high antioxidant activity in vitro and is a new kind of natural antioxidant.
Key words Trachyspermum ammi （L.） Sparuge； Total flavonoids； Free radical； Antioxidant activity
阿育魏实为伞形科糙果芹属[Trachyspermum ammi （L.）Sparμge]植物的干燥成熟果实。全世界糙果芹属植物有12种，分布于非洲至南亚，我国有2种即糙果芹和马尔康糙果芹（T.triadiatum WoLff）及1个变种[T.scaberu Lum（Franch.）WoLff.ex hand-Mazz.var.ambrosii- foLium（Franch）]又称阿米糙果芹[1]。新疆和田、喀什地区普遍栽培[2]，具有驱风散寒，健胃消食，用于食欲不振、胃寒作痛、小便不利、尿路结石、偏瘫及皮肤病等。阿育魏实所含麝香草酚，对口腔、咽喉粘膜有杀细菌和真菌的作用，对龋齿有防腐和局麻作用[3]，还用于皮肤化脓性感染及真菌和放线菌病，其醇提物（10%）对葡萄球菌、大肠杆菌有抑制作用，其稀释液可作祛痰剂[4]。阿育魏实用于很多维吾尔药的复方制剂中，是常用的药材品种，收载于中华人民共和国药品标准维吾尔药分册[5]。在印度等地阿育魏实被用作香料，也作为糕点和饮料添加剂和防腐剂[6]。
为了进一步开发利用阿育魏实资源，笔者以阿育魏实总黄酮为研究对象，采用羟自由基、超氧阴离子自由基、亚硝基自由基、DPPH自由基、ABTS自由基体系对阿育魏实总黄酮抗氧化的能力进行研究，以期为阿育魏实总黄酮的开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象。阿育魏实种子，购自自治区维吾尔医院、喀什地区维吾尔医院、和田地区维吾尔医院，经新疆医科大学药学院天然药物化学教研室帕丽达·阿布利孜教授鉴定为伞形科糙果芹属[Trachyspermum ammi （L.）Sparμge]的成熟果实。
1.1.2 主要仪器。UV-2550型分光光度计，购自日本岛津公司；SK2510HP超声波清洗仪，购自上海科导超声清洗仪有限公司；XS105型十万分之一电子天平，购自瑞士梅特勒-托利多公司。
1.1.3 主要试剂。芦丁对照品，购自中国药品生物制品检定所；OH试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；二苯代苦味肼基自由基，购自DPPH.sigma公司；ABTS，购自sigma公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris）、亚硝酸钠、对氨基苯磺酸和盐酸萘乙二胺，均购自上海缘聚生物科技有限公司；浓盐酸、无水乙醇、三氯化铝均为分析纯，市售；水为超纯水，实验室自制。
1.2方法
1.2.1 阿育魏实黄酮工作液的制备。精密称取阿育魏实样品：自治区维吾尔医院1.000 6 g，喀什地区维吾尔医院1.000 4 g，田地区维吾尔医院1.000 2 g，分别置于索氏提取器中，用石油醚加热回流30 min，弃去提取液，挥干残渣，然后加入浓度60%乙醇50 ml超声2次，每次30 min，过滤，用浓度60%的乙醇定容至100 ml，摇匀备用。 1.2.2 芦丁标准曲线的绘制[7]。精密称取120 ℃干燥恒重的芦丁对照品10.00 mg，用浓度60%的乙醇溶解，定容为100 ml，即配置成浓度为100 μg/ml标准溶液。准确吸取芦丁标准溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0和2.4 ml分别置于10 ml容量瓶中，加入浓度5%的三氯化铝溶液3 ml，pH=6的醋酸-醋酸钠缓冲液1 ml，最后用浓度60%的乙醇定容，摇匀，即配成标准工作溶液。荧光测定条件优化为：激发波长429.0 nm，发射波长529.0 nm，激发光谱通带10.0 nm，发射光谱通带5.0 nm，测定溶液的pH=6的条件下绘制芦丁标准曲线。
1.2.3 阿育魏实总黄酮含量测定。精密量取样品溶液0.5 ml至10 ml容量瓶中，加入浓度5%的三氯化铝3 ml，pH=6的醋酸-醋酸钠缓冲液1 ml，最后用浓度60%的乙醇定容至10 ml 。按“1.2.2”项下条件操作。
1.2.4 对超氧阴离子自由基O-2·的清除能力[8-9]。采用邻苯三酚自氧化法，在碱性条件下邻苯三酚迅速发生自氧化，生成红色中间产物同时释放出O-2·，O-2·可加速邻苯三酚自氧化速率。 当有清除剂存在时可清除O-2·，从而阻止中间产物的积累，通过比色法检验物质清除O-2·的能力。测定步骤为：取0.05 mol/L的pH=8.2的Tris-Hcl缓冲液4.5 ml于试管中，置25 ℃水浴中预热20 min，分别加入样品溶液0.1 ml后均加入2.5 mmol/L 的邻苯三酚0.4 ml，混匀后25 ℃水浴中准确反应4 min，立即加入8 mol/L的HCL两滴终止反应，蒸馏水调零在300 nm处测吸光度，空白以0.1 ml蒸馏水代替样品试液。按下式计算清除率：O-2·清除率（%）=（V空白-V样品）/ V空白×100。
1.2.5 对·OH的清除能力[8-9]。参照Fenton反应法建立·OH自由基体系模型：H2O2与Fe2+混合后产生·OH的Fenton反应为：H2O2+Fe2+=OH-+·OH + Fe3+，试验操作按照南京建成生物工程研究所提供的·OH试剂盒说明书进行。在反应体系中分别加入样品溶液0.2 ml，检测体系中的·OH的剩余量。按下式计算阿育魏实总黄酮对·OH的清除率：·OH清除率（%）=（对照管OD-测定管OD）/ 对照管OD×100。
1.2.6 对亚硝基自由基NO-2的清除能力[10]。亚硝酸钠在弱酸性条件下与对氨基苯磺酸重氮化后再与N-1-苯基乙二胺盐酸盐偶合生成的红色化合物540 nm处有特征吸收峰，加入清除剂后可有效清除NO-2，使亚硝酸钠含量减少，从而使红色化合物生成减少，吸光度值下降，可通过添加试样前后吸光度值的变化判定试样对NO-2的清除效果。测定步骤为：取3支试管a、b、c，准确吸取0.5 ml的浓度为5 μg/ml的亚硝酸钠溶液2份分别加入到a和c中，在a和b管中加入样品溶液1 ml，反应10 min后，a、b、c管分别加入浓度0.4%的对氨基苯磺酸溶液1.0 ml，摇匀反应5 min，再加入浓度0.2%的N-1-苯基乙二胺盐酸盐1.0 ml，摇匀15 min后在最大吸收波长540 nm处测定吸光度。按下式计算阿育魏实总黄酮对NO-2的清除率：NO-2清除率（%）=Ao-（Ai-Aj）/Ao×100。式中：Ao为不加样品溶液的吸光度；Ai为加入样品溶液后的吸光度；Aj为不加亚硝酸钠溶液的吸光度。
1.2.7 对DPPH自由基的清除能力[11]。DPPH自由基是一种稳定的有机自由基，由于DPPH自由基有一个单电子并在517 nm处有强的吸收，其乙醇溶液呈深紫色，如果有其他物质提供一个电子使此单电子配对，其吸收将会消失，褪色程度与其接受的电子呈定量关系。测定步骤为：取2 ml的样品溶液于5 ml容量瓶中，加入2 ml浓度为2×10-4 mol/L的DPPH溶液混合均匀，密闭静止30 min后，在517 nm处测定其吸光度Ai，2 ml的0.1 mg/ml样品与2 ml醇溶液测定吸光度为Aj，2 ml DPPH溶液与2 ml 2次蒸馏水的吸光度Ao。按下式计算阿育魏实总黄酮对DPPH自由基的清除率。DPPH自由基清除率（%）=[ Ao-（Ai-Aj）]/Ao×100。式中：Ao为未加抗氧化剂时DPPH溶液的吸光度；Ai为加抗氧化剂后DPPH溶液的吸光度；Aj为抗氧化剂在测定波长的吸光度。
1.2.8 ABTS自由基的清除能力[11]。取7 mol/L的ABTS和140 mmol/L的过硫酸钾溶液分别取5 ml和88 μl，在室温避光条件下静置过夜，配置ABTS自由基储备液，然后按照1∶50的比例用蒸馏水稀释成工作液。样品管中加入200 μl的样品溶液和3 ml的ABTS工作液，空白管用2次蒸馏水代替样品溶液，对照管用2次蒸馏水代替ABTS溶液，在室温条件下避光放置1 h，于730 nm处测定吸光度。按下式计算阿育魏实总黄酮对ABTS自由基的清除率。ABTS自由基清除率（%）=[Ao-（Ai-Aj）]/Ao×100。
2结果与分析
2.1阿育魏实总黄酮含量的测定 计算得芦丁回归方程问：Y=19.156X-0.090 5，R=0.999 8。试验结果表明，在4～24 μg/ml范围内，芦丁浓度与吸光度具有良好的线性关系。按回归方程计算阿育魏实总黄酮含量，和田地区总黄酮含量最高，为（14.06±0.26）mg/g；其次为喀什地区，含量为（13.72±0.21）mg/g；最小的为自治区维医院 ，含量为（13.24±0.23）mg/g（表 1）。
2.2阿育魏实不同浓度总黄酮清除各自由基的能力 图 1表明，阿育魏实总黄酮对羟基自由基、超氧阴离子自由基、亚硝基自由基、DPPH自由基、ABTS自由基都有一定的清除作用，在质量浓度0.025～0.5 mg/ml的范围内，其清除各自由基的能力分别为31.68%～99.01%、27.45%～90.52%、11.62%～86.40%、41.31%～92.21%和17.53%～62.67%，且随着浓度的增加，其对上述各自由基的清除能力增强，即两者之间存在量效关系。阿育魏实总黄酮浓度对各自由基清除率的变化曲线，对羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基以质量浓度的对数对清除率进行线性回归，计算IC50分别为0.038 49、0.053 51和0.271 60 mg/ml，对亚硝基自由基、ABTS自由基以质量浓度对清除率进行线性回归，计算IC50分别为0.026 17和0.033 87 mg/ml。结果发现，阿育魏实总黄酮对各自由基的清除能力有差别，IC50越低，清除自由基的能力越强，阿育魏实总黄酮对上述自由基的清除能力为：清除DPPH·能力最强，高于ABTS·，羟基自由基，超氧阴离子自由基，对亚硝基自由基的清除能力最低。所以可以选择性使用阿育魏实总黄酮清除不同的自由基。
关键词 阿育魏实；总黄酮；自由基；抗氧化活性
中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2014）15-04624-02
Abstract[Objective] To evaluate antioxidant capacity of total flavonoids of Trachyspermum ammi （L.） Sparuge. [Methods] Using hydroxyl free radicals， superoxide anion free radicals， nitroso free radicals， DPPH free radicals， and ABTS free radical system on total flavonoids of Trachyspermum ammi （L.） Sparuge. [Results] In the mass concentration within the range of 0.025-0.5 mg/ml， its ability to remove the free radicals was 31.68%-99.01%， 27.45%-90.52%， 11.62%-86.40%， 41.31%-92.21%， and 17.53%-62.67%， and there was significant dose-response relationship. IC50 was 0.038 49 mg/ml， 0.03849 mg/ml， 0.03849 mg/ml， 0.053 51 mg/ml， and 0.033 87 mg/ml respectively. [Conclusion] Total flavonoids of Trachyspermum ammi （L.） Sparuge has high antioxidant activity in vitro and is a new kind of natural antioxidant.
Key words Trachyspermum ammi （L.） Sparuge； Total flavonoids； Free radical； Antioxidant activity
阿育魏实为伞形科糙果芹属[Trachyspermum ammi （L.）Sparμge]植物的干燥成熟果实。全世界糙果芹属植物有12种，分布于非洲至南亚，我国有2种即糙果芹和马尔康糙果芹（T.triadiatum WoLff）及1个变种[T.scaberu Lum（Franch.）WoLff.ex hand-Mazz.var.ambrosii- foLium（Franch）]又称阿米糙果芹[1]。新疆和田、喀什地区普遍栽培[2]，具有驱风散寒，健胃消食，用于食欲不振、胃寒作痛、小便不利、尿路结石、偏瘫及皮肤病等。阿育魏实所含麝香草酚，对口腔、咽喉粘膜有杀细菌和真菌的作用，对龋齿有防腐和局麻作用[3]，还用于皮肤化脓性感染及真菌和放线菌病，其醇提物（10%）对葡萄球菌、大肠杆菌有抑制作用，其稀释液可作祛痰剂[4]。阿育魏实用于很多维吾尔药的复方制剂中，是常用的药材品种，收载于中华人民共和国药品标准维吾尔药分册[5]。在印度等地阿育魏实被用作香料，也作为糕点和饮料添加剂和防腐剂[6]。
为了进一步开发利用阿育魏实资源，笔者以阿育魏实总黄酮为研究对象，采用羟自由基、超氧阴离子自由基、亚硝基自由基、DPPH自由基、ABTS自由基体系对阿育魏实总黄酮抗氧化的能力进行研究，以期为阿育魏实总黄酮的开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象。阿育魏实种子，购自自治区维吾尔医院、喀什地区维吾尔医院、和田地区维吾尔医院，经新疆医科大学药学院天然药物化学教研室帕丽达·阿布利孜教授鉴定为伞形科糙果芹属[Trachyspermum ammi （L.）Sparμge]的成熟果实。
1.1.2 主要仪器。UV-2550型分光光度计，购自日本岛津公司；SK2510HP超声波清洗仪，购自上海科导超声清洗仪有限公司；XS105型十万分之一电子天平，购自瑞士梅特勒-托利多公司。
1.1.3 主要试剂。芦丁对照品，购自中国药品生物制品检定所；OH试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；二苯代苦味肼基自由基，购自DPPH.sigma公司；ABTS，购自sigma公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris）、亚硝酸钠、对氨基苯磺酸和盐酸萘乙二胺，均购自上海缘聚生物科技有限公司；浓盐酸、无水乙醇、三氯化铝均为分析纯，市售；水为超纯水，实验室自制。
1.2方法
1.2.1 阿育魏实黄酮工作液的制备。精密称取阿育魏实样品：自治区维吾尔医院1.000 6 g，喀什地区维吾尔医院1.000 4 g，田地区维吾尔医院1.000 2 g，分别置于索氏提取器中，用石油醚加热回流30 min，弃去提取液，挥干残渣，然后加入浓度60%乙醇50 ml超声2次，每次30 min，过滤，用浓度60%的乙醇定容至100 ml，摇匀备用。 1.2.2 芦丁标准曲线的绘制[7]。精密称取120 ℃干燥恒重的芦丁对照品10.00 mg，用浓度60%的乙醇溶解，定容为100 ml，即配置成浓度为100 μg/ml标准溶液。准确吸取芦丁标准溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0和2.4 ml分别置于10 ml容量瓶中，加入浓度5%的三氯化铝溶液3 ml，pH=6的醋酸-醋酸钠缓冲液1 ml，最后用浓度60%的乙醇定容，摇匀，即配成标准工作溶液。荧光测定条件优化为：激发波长429.0 nm，发射波长529.0 nm，激发光谱通带10.0 nm，发射光谱通带5.0 nm，测定溶液的pH=6的条件下绘制芦丁标准曲线。
1.2.3 阿育魏实总黄酮含量测定。精密量取样品溶液0.5 ml至10 ml容量瓶中，加入浓度5%的三氯化铝3 ml，pH=6的醋酸-醋酸钠缓冲液1 ml，最后用浓度60%的乙醇定容至10 ml 。按“1.2.2”项下条件操作。
1.2.4 对超氧阴离子自由基O-2·的清除能力[8-9]。采用邻苯三酚自氧化法，在碱性条件下邻苯三酚迅速发生自氧化，生成红色中间产物同时释放出O-2·，O-2·可加速邻苯三酚自氧化速率。 当有清除剂存在时可清除O-2·，从而阻止中间产物的积累，通过比色法检验物质清除O-2·的能力。测定步骤为：取0.05 mol/L的pH=8.2的Tris-Hcl缓冲液4.5 ml于试管中，置25 ℃水浴中预热20 min，分别加入样品溶液0.1 ml后均加入2.5 mmol/L 的邻苯三酚0.4 ml，混匀后25 ℃水浴中准确反应4 min，立即加入8 mol/L的HCL两滴终止反应，蒸馏水调零在300 nm处测吸光度，空白以0.1 ml蒸馏水代替样品试液。按下式计算清除率：O-2·清除率（%）=（V空白-V样品）/ V空白×100。
1.2.5 对·OH的清除能力[8-9]。参照Fenton反应法建立·OH自由基体系模型：H2O2与Fe2+混合后产生·OH的Fenton反应为：H2O2+Fe2+=OH-+·OH + Fe3+，试验操作按照南京建成生物工程研究所提供的·OH试剂盒说明书进行。在反应体系中分别加入样品溶液0.2 ml，检测体系中的·OH的剩余量。按下式计算阿育魏实总黄酮对·OH的清除率：·OH清除率（%）=（对照管OD-测定管OD）/ 对照管OD×100。
1.2.6 对亚硝基自由基NO-2的清除能力[10]。亚硝酸钠在弱酸性条件下与对氨基苯磺酸重氮化后再与N-1-苯基乙二胺盐酸盐偶合生成的红色化合物540 nm处有特征吸收峰，加入清除剂后可有效清除NO-2，使亚硝酸钠含量减少，从而使红色化合物生成减少，吸光度值下降，可通过添加试样前后吸光度值的变化判定试样对NO-2的清除效果。测定步骤为：取3支试管a、b、c，准确吸取0.5 ml的浓度为5 μg/ml的亚硝酸钠溶液2份分别加入到a和c中，在a和b管中加入样品溶液1 ml，反应10 min后，a、b、c管分别加入浓度0.4%的对氨基苯磺酸溶液1.0 ml，摇匀反应5 min，再加入浓度0.2%的N-1-苯基乙二胺盐酸盐1.0 ml，摇匀15 min后在最大吸收波长540 nm处测定吸光度。按下式计算阿育魏实总黄酮对NO-2的清除率：NO-2清除率（%）=Ao-（Ai-Aj）/Ao×100。式中：Ao为不加样品溶液的吸光度；Ai为加入样品溶液后的吸光度；Aj为不加亚硝酸钠溶液的吸光度。
1.2.7 对DPPH自由基的清除能力[11]。DPPH自由基是一种稳定的有机自由基，由于DPPH自由基有一个单电子并在517 nm处有强的吸收，其乙醇溶液呈深紫色，如果有其他物质提供一个电子使此单电子配对，其吸收将会消失，褪色程度与其接受的电子呈定量关系。测定步骤为：取2 ml的样品溶液于5 ml容量瓶中，加入2 ml浓度为2×10-4 mol/L的DPPH溶液混合均匀，密闭静止30 min后，在517 nm处测定其吸光度Ai，2 ml的0.1 mg/ml样品与2 ml醇溶液测定吸光度为Aj，2 ml DPPH溶液与2 ml 2次蒸馏水的吸光度Ao。按下式计算阿育魏实总黄酮对DPPH自由基的清除率。DPPH自由基清除率（%）=[ Ao-（Ai-Aj）]/Ao×100。式中：Ao为未加抗氧化剂时DPPH溶液的吸光度；Ai为加抗氧化剂后DPPH溶液的吸光度；Aj为抗氧化剂在测定波长的吸光度。
1.2.8 ABTS自由基的清除能力[11]。取7 mol/L的ABTS和140 mmol/L的过硫酸钾溶液分别取5 ml和88 μl，在室温避光条件下静置过夜，配置ABTS自由基储备液，然后按照1∶50的比例用蒸馏水稀释成工作液。样品管中加入200 μl的样品溶液和3 ml的ABTS工作液，空白管用2次蒸馏水代替样品溶液，对照管用2次蒸馏水代替ABTS溶液，在室温条件下避光放置1 h，于730 nm处测定吸光度。按下式计算阿育魏实总黄酮对ABTS自由基的清除率。ABTS自由基清除率（%）=[Ao-（Ai-Aj）]/Ao×100。
2结果与分析
2.1阿育魏实总黄酮含量的测定 计算得芦丁回归方程问：Y=19.156X-0.090 5，R=0.999 8。试验结果表明，在4～24 μg/ml范围内，芦丁浓度与吸光度具有良好的线性关系。按回归方程计算阿育魏实总黄酮含量，和田地区总黄酮含量最高，为（14.06±0.26）mg/g；其次为喀什地区，含量为（13.72±0.21）mg/g；最小的为自治区维医院 ，含量为（13.24±0.23）mg/g（表 1）。
2.2阿育魏实不同浓度总黄酮清除各自由基的能力 图 1表明，阿育魏实总黄酮对羟基自由基、超氧阴离子自由基、亚硝基自由基、DPPH自由基、ABTS自由基都有一定的清除作用，在质量浓度0.025～0.5 mg/ml的范围内，其清除各自由基的能力分别为31.68%～99.01%、27.45%～90.52%、11.62%～86.40%、41.31%～92.21%和17.53%～62.67%，且随着浓度的增加，其对上述各自由基的清除能力增强，即两者之间存在量效关系。阿育魏实总黄酮浓度对各自由基清除率的变化曲线，对羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基以质量浓度的对数对清除率进行线性回归，计算IC50分别为0.038 49、0.053 51和0.271 60 mg/ml，对亚硝基自由基、ABTS自由基以质量浓度对清除率进行线性回归，计算IC50分别为0.026 17和0.033 87 mg/ml。结果发现，阿育魏实总黄酮对各自由基的清除能力有差别，IC50越低，清除自由基的能力越强，阿育魏实总黄酮对上述自由基的清除能力为：清除DPPH·能力最强，高于ABTS·，羟基自由基，超氧阴离子自由基，对亚硝基自由基的清除能力最低。所以可以选择性使用阿育魏实总黄酮清除不同的自由基。