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关键词葡萄;叶斑病;多基因系统发育;平头炭疽菌
葡萄为葡萄科葡萄属落叶藤本植物，原产于欧洲和亚洲西部，是世界上种植面积最大的水果之一。我国葡萄产量和种植面积长期位居世界前列。在葡萄栽培过程中，有时会在叶片上出现由真菌侵染形成的大小形状不一的斑点，具有传染性，造成叶片局部坏死甚至整片枯黄脱落，对葡萄生产造成不利影响。
目前国内外已经报道的葡萄真菌性叶斑病主要有褐纹病、大褐斑病、小褐斑病、轮斑病、壳针孢叶斑病、环纹叶枯病、假尾孢叶斑病和尾孢叶斑病、角斑叶焦病、叶枯病、黑痣病、枝孢叶斑病，Neopestalotiopsis vitis、Cladosporium hebeiense引起的葡萄叶斑病，以及由链格孢Alternaria alternata、葡萄链格孢A viniferae和乔木链格孢A.arborescens引起的葡萄叶斑病等。近年来辽宁北镇葡萄上出现叶斑病症状，表现为叶上出现圆形或椭圆形小黑斑，病斑周围褪绿变黄，影响叶片功能，进而影响果实产量和品质。
为明确引起该病害的病原菌，对病样进行分离培养，采用多基因系统发育分析结合形态学特征对分离得到的病原菌进行鉴定，以期为该葡萄叶斑病的发生和防治提供参考。
1材料与方法
1.1材料
供试病样及寄主：从辽宁北镇采集出现圆形或椭圆形小型黑色病斑、周围出现褪绿变黄的葡萄叶斑病病叶15片，带回实验室进行组织分离。致病性测定所用‘夏黑’葡萄叶片采自北京葡萄与葡萄酒工程技术研发中心。
马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马鈴薯200 g、葡萄糖20g、琼脂15～18g，加水定容至1000mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。
试剂及仪器：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltri-methylammoniumbromide，CTAB），美国Amresco公司;2×Taq Master Mix和DNA Marker，北京博迈德基因技术有限公司;其他试剂均为国产分析纯。Axio Imager Z2显微镜，德国Carl Zeiss公司;Bio-Rad Gel DocTM XR 凝胶成像仪、C1000 TouchTMThermal Cycler PCR仪，美国Bio-Rad公司;Ep-pendorf AG 5424离心机，德国Eppendorf公司。
1.2方法
1.2.1病原菌的分离与纯化
采用常规组织分离法对具有典型症状的叶片进行分离。首先在病健交界处剪取边长为5mm的方形组织，用75%乙醇消毒30 s，无菌水清洗3次，晾干后置于PDA平板上，将培养皿置于25℃、L//D=12 h//12h条件的培养箱中培养，采用单孢分离法进行菌种纯化，将纯化菌株编号为JzB330152，并在4℃冰箱保存备用。
1.2.2病原菌的分子生物学鉴定及系统发育树构建
采用CTAB法提取菌株的基因组DNA。分别利用rDNA转录问隔区ITS通用引物ITS-4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）/ITS-5（5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’）、3-磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH基因的引物GDF（5’-GC-CGTCAACGAATIGA-3’）几丁质合酶CHS-1基因的引物CHS-79F（5，-TGGGGCAAG-GATGCTTGGAAGAAG-3）CHS-345R（5-TG-GAAGAACCATCTGTGAGAGTTG-3’）、肌动蛋白ACT基因的引物ACT-512F（5，-ATGTG-CAAGGCCGGTTTCGC-3’）/ACT-783R（5’-TAC-GAGTCCTTCTGGCCCAT-3’）微管蛋白TUB2基因的引物BT-2F（5，-GTBCACCTYCAR-ACCGGYCARTG-3’）/BT-4R（5’-CCRGAYTGRC-CRAARACRAAGTTGTC-3’）进行PCR扩增，引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PCR产物送至北京博迈德基因技术有限公司进行测序。在NCBI上对测序结果进行BLAST比对分析，在GenBank中下载相关参考序列，利用MAFF）对所有序列进行比对，利用BioEdit 7.0.9.0软件进行多基因序列整合，而后利用ALTER软件将文件格式转换成nexus格式。最后将序列载人PAUP 4.0b10软件中，用最大简约法（maximumparsimony，MP）构建系统发育树并进行系统发育分析。
1.2.3形态学观察
将纯化后的菌株在PDA平板上于28℃、L//D=12 h//12h的条件下培养7～10 d，观察记录菌落形态如形状、颜色、质地等。在显微镜下观察分生孢子、分生孢子盘的形态特征并测量分生孢子大小，共测量30个分生孢子。
1.2.4致病性测定
选取健康成熟的‘夏黑’葡萄叶片，用1%NaCl0表面消毒30 s，无菌水清洗3次，吹干备用。将纯化后的菌株在PDA平板上培养7d，用血球计数法配制浓度为1×10个/mL的孢子悬浮液备用。采用滴接法对离体叶片分别进行刺伤和无伤接种。每片叶4个接种点，于主叶脉两侧各2个且对称，一侧刺伤接种，另一侧无伤接种，每点接种孢子悬浮液20μL，共处理9片叶，重复3次，以无菌水为空白对照。接种后将叶片置于25℃、相对湿度90%下进行黑暗培养24h，之后在相对湿度65%、光周期L//D=12h//12h条件下培养。观察并记录叶片的发病情况，接种部位出现褐色病斑即为开始发病，直至出现与田间相似的症状时对病斑再次进行组织分离，观察分离物与接种菌株的形态特征，完成柯赫氏法则验证。
2结果与分析
2.1病原菌的分子生物学鉴定
利用ITS、GAPDH、CHS-1、ACT与TUB2共5个基因序列对所得菌株进行PCR特异性扩增，分别得到长度为528、290、249、272 bp和497 bp的片段，以Colletotrichum lindemuthianum CBS144.31作为外群经MP法构建系统发育树，结果显示：JZB330152与平头炭疽菌Colletotrichum truncatum（CBS 151.35’）聚在同一支上，自展支持率为100%（图1）。 2.2病原菌的形态学特征
PDA培养基上病原菌菌落圆形，边缘整齐，菌丝较稀疏，紧贴培养基生长，初期菌落边缘为白色，中心为浅灰色，后期菌落颜色变为深褐色;分生孢子盘黑色堆状突起;分生孢子呈无色，无分隔，新月或镰刀形，两头钝尖，大小为（15.32～28.51）μm×（3.33～6.62）μm。依据形态鉴定和系统发育分析，将葡萄叶斑病的病原菌鉴定为平头炭疽菌Colleto-trichum truncatum（图2）。
2.3致病性测定
无伤和刺伤接种‘夏黑’葡萄叶片，接种后3d均开始发病，7d病斑逐渐向周边扩展，病斑颜色变深，成暗褐色。对照叶片未发病。对发病叶片再次进行组织分离，分離物与原始分离菌株一致，完成柯赫氏法则验证（图3）。
3讨论
本研究对采自辽宁省北镇市的感病葡萄叶片进行了病原菌的分离纯化、形态鉴定、致病性测定及柯赫氏法则验证。并对病原菌的ITS、GAPDH、CHS-1、ACT与TUB2基因进行系统发育分析，结果显示，病原菌与平头炭疽菌Colletotrichum trun-catum模式菌株CBS 151.35聚在同一支上，且自展支持率为100%，结合形态学特征将引起葡萄叶斑病的病原菌鉴定为C truncatum。
在葡萄的栽培中，炭疽病是一种重要的常见病害，主要为害葡萄果实，一般造成葡萄减产10%～20%，日本、澳大利亚等国家报道引起葡萄果实炭疽病的病原菌为胶孢炭疽菌C gloeosporioides和（或）尖孢炭疽菌C acutatum，国内报道引起葡萄炭疽病的病原菌有胶孢炭疽菌、C viniferum、C fructicola以及C aenigma和C hebeiense，2016年笔者在湖北发现引起‘红地球’葡萄嫩梢枯死。目前在我国，平头炭疽菌可危害番茄、火龙果、南瓜等，但平头炭疽菌侵染葡萄仅在瑞士有过报道，我国尚未见相关的研究报道。
据调查，在北镇由炭疽病菌引起的葡萄叶斑病在夏季雨季过后发病严重，说明炭疽病的发生与雨水关系密切，高温高湿的环境有利用于病原菌的生长，因此在病害易发生的季节应加强果园管理，及时清除病叶，避免通风不良、浇水过多的情况发生，病害发生严重时，需选择合适的杀菌剂进行防治。Greer等的研究显示，胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌在侵染特性和对杀菌剂的敏感性方面表现不同。尖孢炭疽菌侵染速度快于胶孢炭疽菌，并且对克菌丹、三环唑的敏感性要显著高于尖孢炭疽菌。而胶孢炭疽菌对苯菌灵的敏感性要高于尖孢炭疽菌。邓维萍等的报道也证实了这点。因此需对平头炭疽菌对杀菌剂的敏感性进行测定，以筛选出高效、安全的药剂投入到葡萄叶斑病的防治中，结合农业栽培、生物防控等多种措施，构建完善的综合防控技术体系，防控病害的进一步发生和蔓延。
葡萄为葡萄科葡萄属落叶藤本植物，原产于欧洲和亚洲西部，是世界上种植面积最大的水果之一。我国葡萄产量和种植面积长期位居世界前列。在葡萄栽培过程中，有时会在叶片上出现由真菌侵染形成的大小形状不一的斑点，具有传染性，造成叶片局部坏死甚至整片枯黄脱落，对葡萄生产造成不利影响。
目前国内外已经报道的葡萄真菌性叶斑病主要有褐纹病、大褐斑病、小褐斑病、轮斑病、壳针孢叶斑病、环纹叶枯病、假尾孢叶斑病和尾孢叶斑病、角斑叶焦病、叶枯病、黑痣病、枝孢叶斑病，Neopestalotiopsis vitis、Cladosporium hebeiense引起的葡萄叶斑病，以及由链格孢Alternaria alternata、葡萄链格孢A viniferae和乔木链格孢A.arborescens引起的葡萄叶斑病等。近年来辽宁北镇葡萄上出现叶斑病症状，表现为叶上出现圆形或椭圆形小黑斑，病斑周围褪绿变黄，影响叶片功能，进而影响果实产量和品质。
为明确引起该病害的病原菌，对病样进行分离培养，采用多基因系统发育分析结合形态学特征对分离得到的病原菌进行鉴定，以期为该葡萄叶斑病的发生和防治提供参考。
1材料与方法
1.1材料
供试病样及寄主：从辽宁北镇采集出现圆形或椭圆形小型黑色病斑、周围出现褪绿变黄的葡萄叶斑病病叶15片，带回实验室进行组织分离。致病性测定所用‘夏黑’葡萄叶片采自北京葡萄与葡萄酒工程技术研发中心。
马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马鈴薯200 g、葡萄糖20g、琼脂15～18g，加水定容至1000mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。
试剂及仪器：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltri-methylammoniumbromide，CTAB），美国Amresco公司;2×Taq Master Mix和DNA Marker，北京博迈德基因技术有限公司;其他试剂均为国产分析纯。Axio Imager Z2显微镜，德国Carl Zeiss公司;Bio-Rad Gel DocTM XR 凝胶成像仪、C1000 TouchTMThermal Cycler PCR仪，美国Bio-Rad公司;Ep-pendorf AG 5424离心机，德国Eppendorf公司。
1.2方法
1.2.1病原菌的分离与纯化
采用常规组织分离法对具有典型症状的叶片进行分离。首先在病健交界处剪取边长为5mm的方形组织，用75%乙醇消毒30 s，无菌水清洗3次，晾干后置于PDA平板上，将培养皿置于25℃、L//D=12 h//12h条件的培养箱中培养，采用单孢分离法进行菌种纯化，将纯化菌株编号为JzB330152，并在4℃冰箱保存备用。
1.2.2病原菌的分子生物学鉴定及系统发育树构建
采用CTAB法提取菌株的基因组DNA。分别利用rDNA转录问隔区ITS通用引物ITS-4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）/ITS-5（5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’）、3-磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH基因的引物GDF（5’-GC-CGTCAACGAATIGA-3’）几丁质合酶CHS-1基因的引物CHS-79F（5，-TGGGGCAAG-GATGCTTGGAAGAAG-3）CHS-345R（5-TG-GAAGAACCATCTGTGAGAGTTG-3’）、肌动蛋白ACT基因的引物ACT-512F（5，-ATGTG-CAAGGCCGGTTTCGC-3’）/ACT-783R（5’-TAC-GAGTCCTTCTGGCCCAT-3’）微管蛋白TUB2基因的引物BT-2F（5，-GTBCACCTYCAR-ACCGGYCARTG-3’）/BT-4R（5’-CCRGAYTGRC-CRAARACRAAGTTGTC-3’）进行PCR扩增，引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PCR产物送至北京博迈德基因技术有限公司进行测序。在NCBI上对测序结果进行BLAST比对分析，在GenBank中下载相关参考序列，利用MAFF）对所有序列进行比对，利用BioEdit 7.0.9.0软件进行多基因序列整合，而后利用ALTER软件将文件格式转换成nexus格式。最后将序列载人PAUP 4.0b10软件中，用最大简约法（maximumparsimony，MP）构建系统发育树并进行系统发育分析。
1.2.3形态学观察
将纯化后的菌株在PDA平板上于28℃、L//D=12 h//12h的条件下培养7～10 d，观察记录菌落形态如形状、颜色、质地等。在显微镜下观察分生孢子、分生孢子盘的形态特征并测量分生孢子大小，共测量30个分生孢子。
1.2.4致病性测定
选取健康成熟的‘夏黑’葡萄叶片，用1%NaCl0表面消毒30 s，无菌水清洗3次，吹干备用。将纯化后的菌株在PDA平板上培养7d，用血球计数法配制浓度为1×10个/mL的孢子悬浮液备用。采用滴接法对离体叶片分别进行刺伤和无伤接种。每片叶4个接种点，于主叶脉两侧各2个且对称，一侧刺伤接种，另一侧无伤接种，每点接种孢子悬浮液20μL，共处理9片叶，重复3次，以无菌水为空白对照。接种后将叶片置于25℃、相对湿度90%下进行黑暗培养24h，之后在相对湿度65%、光周期L//D=12h//12h条件下培养。观察并记录叶片的发病情况，接种部位出现褐色病斑即为开始发病，直至出现与田间相似的症状时对病斑再次进行组织分离，观察分离物与接种菌株的形态特征，完成柯赫氏法则验证。
2结果与分析
2.1病原菌的分子生物学鉴定
利用ITS、GAPDH、CHS-1、ACT与TUB2共5个基因序列对所得菌株进行PCR特异性扩增，分别得到长度为528、290、249、272 bp和497 bp的片段，以Colletotrichum lindemuthianum CBS144.31作为外群经MP法构建系统发育树，结果显示：JZB330152与平头炭疽菌Colletotrichum truncatum（CBS 151.35’）聚在同一支上，自展支持率为100%（图1）。 2.2病原菌的形态学特征
PDA培养基上病原菌菌落圆形，边缘整齐，菌丝较稀疏，紧贴培养基生长，初期菌落边缘为白色，中心为浅灰色，后期菌落颜色变为深褐色;分生孢子盘黑色堆状突起;分生孢子呈无色，无分隔，新月或镰刀形，两头钝尖，大小为（15.32～28.51）μm×（3.33～6.62）μm。依据形态鉴定和系统发育分析，将葡萄叶斑病的病原菌鉴定为平头炭疽菌Colleto-trichum truncatum（图2）。
2.3致病性测定
无伤和刺伤接种‘夏黑’葡萄叶片，接种后3d均开始发病，7d病斑逐渐向周边扩展，病斑颜色变深，成暗褐色。对照叶片未发病。对发病叶片再次进行组织分离，分離物与原始分离菌株一致，完成柯赫氏法则验证（图3）。
3讨论
本研究对采自辽宁省北镇市的感病葡萄叶片进行了病原菌的分离纯化、形态鉴定、致病性测定及柯赫氏法则验证。并对病原菌的ITS、GAPDH、CHS-1、ACT与TUB2基因进行系统发育分析，结果显示，病原菌与平头炭疽菌Colletotrichum trun-catum模式菌株CBS 151.35聚在同一支上，且自展支持率为100%，结合形态学特征将引起葡萄叶斑病的病原菌鉴定为C truncatum。
在葡萄的栽培中，炭疽病是一种重要的常见病害，主要为害葡萄果实，一般造成葡萄减产10%～20%，日本、澳大利亚等国家报道引起葡萄果实炭疽病的病原菌为胶孢炭疽菌C gloeosporioides和（或）尖孢炭疽菌C acutatum，国内报道引起葡萄炭疽病的病原菌有胶孢炭疽菌、C viniferum、C fructicola以及C aenigma和C hebeiense，2016年笔者在湖北发现引起‘红地球’葡萄嫩梢枯死。目前在我国，平头炭疽菌可危害番茄、火龙果、南瓜等，但平头炭疽菌侵染葡萄仅在瑞士有过报道，我国尚未见相关的研究报道。
据调查，在北镇由炭疽病菌引起的葡萄叶斑病在夏季雨季过后发病严重，说明炭疽病的发生与雨水关系密切，高温高湿的环境有利用于病原菌的生长，因此在病害易发生的季节应加强果园管理，及时清除病叶，避免通风不良、浇水过多的情况发生，病害发生严重时，需选择合适的杀菌剂进行防治。Greer等的研究显示，胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌在侵染特性和对杀菌剂的敏感性方面表现不同。尖孢炭疽菌侵染速度快于胶孢炭疽菌，并且对克菌丹、三环唑的敏感性要显著高于尖孢炭疽菌。而胶孢炭疽菌对苯菌灵的敏感性要高于尖孢炭疽菌。邓维萍等的报道也证实了这点。因此需对平头炭疽菌对杀菌剂的敏感性进行测定，以筛选出高效、安全的药剂投入到葡萄叶斑病的防治中，结合农业栽培、生物防控等多种措施，构建完善的综合防控技术体系，防控病害的进一步发生和蔓延。