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摘要:中药含药血清作为干预手段在中药药理研究体外实验中越来越受到广大科研工作者的重视,并取得一定的进展。科学、严谨、标准的实验设计方案贯穿于整个中药含药血清制备的全过程,直接影响到血清中药物有效成分的含量、活性等,对于模拟中药在体内真实药理活动过程至关重要,也是中药及复方体外实验研究取得成功的关键点。基于课题组在进行中药复方养营活血汤含药血清制备的过程中,查阅相关文献及制备方法,对中药含药血清制备进行详细的梳理,并提出一些见解,以飨同道。
关键词:含药血清;制备方法;研究
中图分类号:R285.5 文献标志码:A 文章编号:1007-2349(2021)09-0051-05
中药含药血清是指根据实验设计的需要用中药(单味或复方)按照一定的剂量、规定的剂型(大多用中药煎汤)和预定的给药次数、给药时间等对特定的动物如大鼠、小鼠、豚鼠和兔等进行灌胃后,选择适宜的采血法在拟定的时间内采集动物的血液并对其进行分离,最后得到的含有药物本身、药物代谢产物、活性成分、杂质成分和一定酸碱度变化等的血清复合物。中药含药血清是用于代替原药物的粗提物作为供试材料进行体外实验的,其可避免中药复方粗提物本身的理化性质等对实验结果的干扰[1]。
1 中药含药血清制备的研究现状
1.1 动物种属的选择 中药含药血清的制备首先要考虑供体动物的选择,不同种属、年龄的动物对药物吸收也不相同,因而造成血药成分、浓度的差异[2]。有报道因药物不同、被采血动物的种属差异及同一种属间的个体差别而获得的含药血清中各种因子含量也不尽相同,并由此在后续的试验中可能会影响到细胞贴壁[3]。所以,欲获得合理可信的实验结果,必须在一开始就有较为合理的实验设计。
动物种属的选择要求同质性。所谓的同质性即含药血清的供体动物需要与体外试验用的离体器官、组织和细胞的供体动物能够保持统一的标准,只有在标准相同的前提下实验结果才最有意义。具体表现在选择动物时应特别强调保证动物的种属一致、年龄相同、同一性别及体重基本相等等方面,而且,供体动物应该造模,即在相同的生理病理状态下获得的含药血清才最有实验价值。在目前多数研究中血清供体动物均选用的是正常动物,忽略了血清供体动物造模[4]。因此,上述问题还需进一步深入讨论。
最好选择与人类生物特性相似的动物如正常的小鼠、大鼠和兔等进行实验研究。
1.2 动物的给药方案 动物的给药方案主要包括给药剂量、给药次数、给药时间和给药途径等,其中最为重要的是给药剂量。通常认为中药含药血清中血药浓度的高低是由机体当时的血药浓度决定的,即含药血清的浓度(体积比)越高就意味着药物的效果越明显,而该血药浓度与给药剂量存在一定量效关系,但是,有研究提示动物体内给药剂量、中药含药血清的药物浓度与药效强弱三者之间并非呈平行关系[5]。
给药的方法包括:固定容量给药法,如制备某含药血清时按固定容量2 ml/次给药,即在保持容量不变的基础上通过调整给动物灌胃的药物浓度而达到目标剂量;固定药物质量给药法,如制备某含药血清时按固定质量2 g/次给药;固定药物容量和质量给药法,即结合规定容量给药法又参考规定质量给药法;按单位体质量药物给药量给药,有报道在复方六月雪含药血清制备时予以复方六月雪高、中、低剂量组分别是6.6 mg/(kg·d)、3.3 mg/(kg·d)和1.7 mg/(kg·d)给药[6];按人体等效剂量倍数给药,如陈彩霞等[7]制备金欣口服液含药血清时对实验动物予以金欣口服液36 g/(kg·d)(相当于人临床等效剂量的4倍)进行灌胃;或按临床成人用量的倍数给药,如陆海英等[8]在制备中药抗纤灵方含药血清时灌胃量取10倍于人的有效剂量,即每只大鼠每天灌服药液3ml(含生药6g)。以上几种给药方案一定要结合具体实验酌情选用,需要注意的是,以200 g左右大鼠为例,考虑到其胃的容积,每次灌胃剂量最好不超过2ml。课题组在制备养营活血汤含药血清时是按照大鼠与成人的每千克体重等效剂量折算系数6.25换算大鼠用药剂量灌胃给药。
1.3 动物的给药时间 为减轻动物的不适和避免其它因素可能带来的干扰,建议每次在给动物进行灌胃前先禁食8~12 h,且給药时间应安排在动物空腹状态下最为合理。
有人认为,在给动物或人服药1周甚至10 d 之后所取得的血清,尽管此时已接近或模拟了体内的药物实际情况,但已不再是药物本身,因其中的有些活性成分被胃酸灭活、或在肝脏中被灭活,当然无法再认为是该药物的单纯作用了。也有人提出快速给药、短时间内取血的血清制作方法,可是在实验中又发现用这种方法所制作的血清药效较差而导致无法进行后续的实验。
课题组在制备中药含药血清时采用每12 h对大鼠灌胃给药1次,连续给药3 d(即共6次),于末次给药1.5 h后采血。也有其他多种不同的给药方案,如肖政华等[9]制备扶肝化纤汤含药血清时采用日1次,连续6 d,第7 d重复给药2次,间隔时间2 h,于末次给药后1 h予腹腔注射麻醉大鼠,腹主动脉取血。
1.4 动物的采血时机 采血时机主要指药物与动物作用的最佳时间节点,与药物代谢的时间密切相关,牵涉到药代和药动两方面。理论上讲,中药含药血清采血时间应落在血药浓度的高峰期,但因每种药物达到血药浓度的高峰期也不尽相同,故在进行具体实验时,应根据所选药物的种类、实验目地和预实验结果等,结合不同种类药物的药物峰值而选择不同的采血时间[10]。
研究发现在对动物末次给药后1 h和2 h取血点获得的血清药效较强[11]。可见最理想的采血时间应在动物末次给药后1~2 h之内,课题组制备中药复方含药血清时是将采血时间安排在动物末次给药后的1.5h,应注意的是按每组大鼠末次给药的先后顺序依次进行采血,尽量使每只大鼠末次给药时间与采血时间均间隔1.5 h,按此法制备的含药血清在后续的体外实验中发现药效良好。 1.5 动物的采血方法 目前常用的动物采血方法及优缺点如下:眼眶静脉丛采血具有操作简便、取血量大、血流速度快的优点,缺点是进针深度难以控制且易凝血;割(剪)尾取血损伤小,但取血量少且易感染;心脏采血有定位准确、取血量大、操作简便的特点,但是应注意麻醉药深度,不可过量;腹主动脉采血法的优点在于血量大且不易溶血,但操作相对复杂和对技术性要求较高。
1.6 动物含药血清的过滤及存储 多数观点支持对大鼠含药血清进行过滤除菌。具体做法是将大鼠称重后,水合氯醛腹腔注射麻醉,在无菌条件下进行腹主动脉取血,静置1小时后,在4℃、3000 rpm/min离心10 min,取上层血清用0.22 μm滤器过滤后再分装至1.5 mL冻存管中。
含药血清的储存一般分为-20℃和-80℃低温冻存,依据实验时间的长短选择,因过长的储存时间可能会影响到含药血清的作用,故建议以短期储存为好。
2 中药含药血清制备存在的问题及思考
目前,尽管中药含药血清作为重要的干预手段已广泛应用于临床研究中,但是仍存在很多的问题需要我们去进一步探讨和完善。
2.1 动物的选择方案需要标准化 标准化的动物选择方案对下一步的实验起决定性作用,只有在统一标准下制备的中药含药血清进行体外实验所获得的数据才最有说服力。建议在实验设计的初期选择动物时应注意:(1)同步化,即各实验组采用同种正常血清,使细胞在24h或更长的时间内在贴壁率上达到一致。(2)药物血清实验组和对照组的血清必须采自同一种属的同类动物,即年龄和性别相同、体重基本统一等。(3)用于培养细胞与制备含药血清的动物应保持同一种属,即人的含药血清仅能用于人的细胞。
2.2 血清供体动物造模的必要性 近年来科学家们发现即使同一种药物,其药代动力学参数可因人群、生理、病理或遗传背景的不同呈现差异[12]。当前,国内很多研究者在应用中药含药血清进行体外实验时,这些含药血清大部分来自于正常动物而非造模的动物,严格来讲,这种实验设计方案的合理性是需要讨论的。韦振源[13]认为,不同个体对同一种药物的药代动力学参数在不同生理、病理条件下,由于机体的状态不同会出现不同的结果,血液中的物质成份也会发生变化,从而对实验结果造成一定程度的影响,使之不能真实地反映所研究的单味中药或复方的作用。故建议最好使用病理状态下制备的含药血清进行后续的实验。
2.3 不同证型对药物浓度的影响 即使同一疾病,因证型不同,机体对药物体内代谢也将产生不同的影响。据中医辨证论治理论提出的证治药动学假说,有学者对药物相同而“证”不同的药代动力学参数经统计学处理后发现有明显差别,从而影响到药物疗效和毒性反应,然而经用辨证施治后发现这种差别已消失,或较前明显减轻[14]。可见不同证型对药物浓度和成份将产生一定影响,因此建议在动物疾病相同和证型相同的基础上制备含药血清才是最科学的。
2.4 个体化的采血时点更为贴切 在含药血清制备过程中,保证血药浓度和药效强弱的关键在于动物的给药剂量、次数和采血时点。中药给药后达峰值时间可因其成分不同结果亦有差别,故采血时点尚不能统一。现阶段较通用的给药方法为1次/d,连续3~5 d,或2次/d,连续3 d,末次灌胃后1~3 h 取血。在此建议,于大部分实验而言,需要考虑采用通用的给药方法并结合预实验结果进行个体化调整。
2.5 中药复方标准及配伍机制 建立中药复方质量的标准化,有报道的方案即首先通过中药血清药物化学的方法来研究确定中药体内直接作用物质,并以此为指标再通过高效液相色谱(HPLC)、指纹图谱等手段建立国际标准化的定性[15]。毫无疑问,这给我们深入研究中药复方质量的标准提供了指导和方向。
中药复方配伍科学、临床常用且疗效可靠,但对其配伍规律的现代研究尚在探索当中[16]。中药血清药物化学可在一定程度上解释复方的配伍规律,其先对复方入血成分进行全面分析并确定复方药效物质的基础,再通过研究主要药效成分的体内动态、成分间相互作用及消长规律[17]。总之,研究中药复方在体内的作用形式和作用机制最好通过血清化学分析与血清药理实验相结合的方法[18]。
2.6 含药血清的灭活尚有争议 目前最常用的是水浴灭活的方法,即在进行体外实验之前,将装有中药含药血清的冻存管放置于56℃水浴中灭活30min[19]。因在新鲜制备的血清中常含有一定量的补体,它们大多数是酶原、酶及酶的抑制剂或激动剂,其具有機体防御和清除病原微生物等作用[20]。但是,药物血清的灭活将对这部分具有一定活性的物质产生影响,继而影响到药理实验结果,且无法与体内实验和临床用药情况符合一致[21]。
尽管对血清灭活这一常规处理方法存在争议,但是笔者建议最好结合预实验,观察灭活后和未进行灭活的含药血清在体外实验中的反应结果予以充分考虑。血清灭活是有必要的,因在动物含药血清制备过程中是很难绝对防止到微生物感染的。
2.7 体外实验中含药血清的添加量与对照组的设定 药物血清的药理效应并非因动物体内给药量越大就会越好[22]。研究发现采用不同浓度的含药血清进行实验时其对细胞增殖的促进或抑制作用及对细胞的毒性作用亦不相同[23]。在体外实验中含药血清的添加量也呈现多样化,故在确定体外实验中含药血清的添加量时除参考相关文献外,预实验结果也可对选择合适的添加量进行下一步实验做出指导。原则上既要关注高浓度血清对细胞的毒性,也应考虑使含药血清的浓度尽量接近于血药浓度[24]。
设立空白血清作为对照组是为了避免血清本身具有的活性给实验结果带来影响[25]。在设立对照组时,当用一种药物剂量(如用某中药复方高剂量)给大鼠灌胃获得的含药血清,而采用不同体积分别作为不同剂量组时,对照组则应选择相应的不同体积空白血清,且在数据处理时应以实际测得数据表示;当用不同剂量的药物(如用某中药复方高、中、低剂量)给予大鼠灌胃获得的含药血清时,应取同体积的血清作为不同药物剂量组,则对照组仅需设立一组等体积空白血清[26]。总之,正确选择含药血清的添加量和设定对照组将直接关系到后续实验的结果。课题组在进行中药含药血清制备时是采用中药复方汤剂高、中、低剂量给大鼠灌胃,在设立空白血清作为对照组时用一组等体积空白血清。 3 小结
综上,应用中药含药血清进行体外实验的方法是可行的,但仍需要深入探索和研究。在对中药及复方进行研究时,建议结合血清药理学实验和中药血清药物化学的研究结果,参考给药后入血成分数和量的变化规律来严格制订合理的给药及采血方案,并依据血清色谱指纹图选择适当的方法去除血清中固有成分及内源性杂质等[27]。随着对含药血清成份分离和分析手段的提高,中药血清药理学研究将会得到进一步的发展和完善,因含药血清成分复杂致实验结果重复性差的问题将会得到逐步解决[28]。细节决定成败,有时候看似极其微小的细节问题却可能会影响到总体的结局。所以,在整个中药含药血清制备的全过程,一定要关注到每一个细节,以严谨求实的态度认真对待实验中的各个环节,从而使制备的中药含药血清最大限度的模拟真实临床状态。
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(收稿日期:2021-05-09)
关键词:含药血清;制备方法;研究
中图分类号:R285.5 文献标志码:A 文章编号:1007-2349(2021)09-0051-05
中药含药血清是指根据实验设计的需要用中药(单味或复方)按照一定的剂量、规定的剂型(大多用中药煎汤)和预定的给药次数、给药时间等对特定的动物如大鼠、小鼠、豚鼠和兔等进行灌胃后,选择适宜的采血法在拟定的时间内采集动物的血液并对其进行分离,最后得到的含有药物本身、药物代谢产物、活性成分、杂质成分和一定酸碱度变化等的血清复合物。中药含药血清是用于代替原药物的粗提物作为供试材料进行体外实验的,其可避免中药复方粗提物本身的理化性质等对实验结果的干扰[1]。
1 中药含药血清制备的研究现状
1.1 动物种属的选择 中药含药血清的制备首先要考虑供体动物的选择,不同种属、年龄的动物对药物吸收也不相同,因而造成血药成分、浓度的差异[2]。有报道因药物不同、被采血动物的种属差异及同一种属间的个体差别而获得的含药血清中各种因子含量也不尽相同,并由此在后续的试验中可能会影响到细胞贴壁[3]。所以,欲获得合理可信的实验结果,必须在一开始就有较为合理的实验设计。
动物种属的选择要求同质性。所谓的同质性即含药血清的供体动物需要与体外试验用的离体器官、组织和细胞的供体动物能够保持统一的标准,只有在标准相同的前提下实验结果才最有意义。具体表现在选择动物时应特别强调保证动物的种属一致、年龄相同、同一性别及体重基本相等等方面,而且,供体动物应该造模,即在相同的生理病理状态下获得的含药血清才最有实验价值。在目前多数研究中血清供体动物均选用的是正常动物,忽略了血清供体动物造模[4]。因此,上述问题还需进一步深入讨论。
最好选择与人类生物特性相似的动物如正常的小鼠、大鼠和兔等进行实验研究。
1.2 动物的给药方案 动物的给药方案主要包括给药剂量、给药次数、给药时间和给药途径等,其中最为重要的是给药剂量。通常认为中药含药血清中血药浓度的高低是由机体当时的血药浓度决定的,即含药血清的浓度(体积比)越高就意味着药物的效果越明显,而该血药浓度与给药剂量存在一定量效关系,但是,有研究提示动物体内给药剂量、中药含药血清的药物浓度与药效强弱三者之间并非呈平行关系[5]。
给药的方法包括:固定容量给药法,如制备某含药血清时按固定容量2 ml/次给药,即在保持容量不变的基础上通过调整给动物灌胃的药物浓度而达到目标剂量;固定药物质量给药法,如制备某含药血清时按固定质量2 g/次给药;固定药物容量和质量给药法,即结合规定容量给药法又参考规定质量给药法;按单位体质量药物给药量给药,有报道在复方六月雪含药血清制备时予以复方六月雪高、中、低剂量组分别是6.6 mg/(kg·d)、3.3 mg/(kg·d)和1.7 mg/(kg·d)给药[6];按人体等效剂量倍数给药,如陈彩霞等[7]制备金欣口服液含药血清时对实验动物予以金欣口服液36 g/(kg·d)(相当于人临床等效剂量的4倍)进行灌胃;或按临床成人用量的倍数给药,如陆海英等[8]在制备中药抗纤灵方含药血清时灌胃量取10倍于人的有效剂量,即每只大鼠每天灌服药液3ml(含生药6g)。以上几种给药方案一定要结合具体实验酌情选用,需要注意的是,以200 g左右大鼠为例,考虑到其胃的容积,每次灌胃剂量最好不超过2ml。课题组在制备养营活血汤含药血清时是按照大鼠与成人的每千克体重等效剂量折算系数6.25换算大鼠用药剂量灌胃给药。
1.3 动物的给药时间 为减轻动物的不适和避免其它因素可能带来的干扰,建议每次在给动物进行灌胃前先禁食8~12 h,且給药时间应安排在动物空腹状态下最为合理。
有人认为,在给动物或人服药1周甚至10 d 之后所取得的血清,尽管此时已接近或模拟了体内的药物实际情况,但已不再是药物本身,因其中的有些活性成分被胃酸灭活、或在肝脏中被灭活,当然无法再认为是该药物的单纯作用了。也有人提出快速给药、短时间内取血的血清制作方法,可是在实验中又发现用这种方法所制作的血清药效较差而导致无法进行后续的实验。
课题组在制备中药含药血清时采用每12 h对大鼠灌胃给药1次,连续给药3 d(即共6次),于末次给药1.5 h后采血。也有其他多种不同的给药方案,如肖政华等[9]制备扶肝化纤汤含药血清时采用日1次,连续6 d,第7 d重复给药2次,间隔时间2 h,于末次给药后1 h予腹腔注射麻醉大鼠,腹主动脉取血。
1.4 动物的采血时机 采血时机主要指药物与动物作用的最佳时间节点,与药物代谢的时间密切相关,牵涉到药代和药动两方面。理论上讲,中药含药血清采血时间应落在血药浓度的高峰期,但因每种药物达到血药浓度的高峰期也不尽相同,故在进行具体实验时,应根据所选药物的种类、实验目地和预实验结果等,结合不同种类药物的药物峰值而选择不同的采血时间[10]。
研究发现在对动物末次给药后1 h和2 h取血点获得的血清药效较强[11]。可见最理想的采血时间应在动物末次给药后1~2 h之内,课题组制备中药复方含药血清时是将采血时间安排在动物末次给药后的1.5h,应注意的是按每组大鼠末次给药的先后顺序依次进行采血,尽量使每只大鼠末次给药时间与采血时间均间隔1.5 h,按此法制备的含药血清在后续的体外实验中发现药效良好。 1.5 动物的采血方法 目前常用的动物采血方法及优缺点如下:眼眶静脉丛采血具有操作简便、取血量大、血流速度快的优点,缺点是进针深度难以控制且易凝血;割(剪)尾取血损伤小,但取血量少且易感染;心脏采血有定位准确、取血量大、操作简便的特点,但是应注意麻醉药深度,不可过量;腹主动脉采血法的优点在于血量大且不易溶血,但操作相对复杂和对技术性要求较高。
1.6 动物含药血清的过滤及存储 多数观点支持对大鼠含药血清进行过滤除菌。具体做法是将大鼠称重后,水合氯醛腹腔注射麻醉,在无菌条件下进行腹主动脉取血,静置1小时后,在4℃、3000 rpm/min离心10 min,取上层血清用0.22 μm滤器过滤后再分装至1.5 mL冻存管中。
含药血清的储存一般分为-20℃和-80℃低温冻存,依据实验时间的长短选择,因过长的储存时间可能会影响到含药血清的作用,故建议以短期储存为好。
2 中药含药血清制备存在的问题及思考
目前,尽管中药含药血清作为重要的干预手段已广泛应用于临床研究中,但是仍存在很多的问题需要我们去进一步探讨和完善。
2.1 动物的选择方案需要标准化 标准化的动物选择方案对下一步的实验起决定性作用,只有在统一标准下制备的中药含药血清进行体外实验所获得的数据才最有说服力。建议在实验设计的初期选择动物时应注意:(1)同步化,即各实验组采用同种正常血清,使细胞在24h或更长的时间内在贴壁率上达到一致。(2)药物血清实验组和对照组的血清必须采自同一种属的同类动物,即年龄和性别相同、体重基本统一等。(3)用于培养细胞与制备含药血清的动物应保持同一种属,即人的含药血清仅能用于人的细胞。
2.2 血清供体动物造模的必要性 近年来科学家们发现即使同一种药物,其药代动力学参数可因人群、生理、病理或遗传背景的不同呈现差异[12]。当前,国内很多研究者在应用中药含药血清进行体外实验时,这些含药血清大部分来自于正常动物而非造模的动物,严格来讲,这种实验设计方案的合理性是需要讨论的。韦振源[13]认为,不同个体对同一种药物的药代动力学参数在不同生理、病理条件下,由于机体的状态不同会出现不同的结果,血液中的物质成份也会发生变化,从而对实验结果造成一定程度的影响,使之不能真实地反映所研究的单味中药或复方的作用。故建议最好使用病理状态下制备的含药血清进行后续的实验。
2.3 不同证型对药物浓度的影响 即使同一疾病,因证型不同,机体对药物体内代谢也将产生不同的影响。据中医辨证论治理论提出的证治药动学假说,有学者对药物相同而“证”不同的药代动力学参数经统计学处理后发现有明显差别,从而影响到药物疗效和毒性反应,然而经用辨证施治后发现这种差别已消失,或较前明显减轻[14]。可见不同证型对药物浓度和成份将产生一定影响,因此建议在动物疾病相同和证型相同的基础上制备含药血清才是最科学的。
2.4 个体化的采血时点更为贴切 在含药血清制备过程中,保证血药浓度和药效强弱的关键在于动物的给药剂量、次数和采血时点。中药给药后达峰值时间可因其成分不同结果亦有差别,故采血时点尚不能统一。现阶段较通用的给药方法为1次/d,连续3~5 d,或2次/d,连续3 d,末次灌胃后1~3 h 取血。在此建议,于大部分实验而言,需要考虑采用通用的给药方法并结合预实验结果进行个体化调整。
2.5 中药复方标准及配伍机制 建立中药复方质量的标准化,有报道的方案即首先通过中药血清药物化学的方法来研究确定中药体内直接作用物质,并以此为指标再通过高效液相色谱(HPLC)、指纹图谱等手段建立国际标准化的定性[15]。毫无疑问,这给我们深入研究中药复方质量的标准提供了指导和方向。
中药复方配伍科学、临床常用且疗效可靠,但对其配伍规律的现代研究尚在探索当中[16]。中药血清药物化学可在一定程度上解释复方的配伍规律,其先对复方入血成分进行全面分析并确定复方药效物质的基础,再通过研究主要药效成分的体内动态、成分间相互作用及消长规律[17]。总之,研究中药复方在体内的作用形式和作用机制最好通过血清化学分析与血清药理实验相结合的方法[18]。
2.6 含药血清的灭活尚有争议 目前最常用的是水浴灭活的方法,即在进行体外实验之前,将装有中药含药血清的冻存管放置于56℃水浴中灭活30min[19]。因在新鲜制备的血清中常含有一定量的补体,它们大多数是酶原、酶及酶的抑制剂或激动剂,其具有機体防御和清除病原微生物等作用[20]。但是,药物血清的灭活将对这部分具有一定活性的物质产生影响,继而影响到药理实验结果,且无法与体内实验和临床用药情况符合一致[21]。
尽管对血清灭活这一常规处理方法存在争议,但是笔者建议最好结合预实验,观察灭活后和未进行灭活的含药血清在体外实验中的反应结果予以充分考虑。血清灭活是有必要的,因在动物含药血清制备过程中是很难绝对防止到微生物感染的。
2.7 体外实验中含药血清的添加量与对照组的设定 药物血清的药理效应并非因动物体内给药量越大就会越好[22]。研究发现采用不同浓度的含药血清进行实验时其对细胞增殖的促进或抑制作用及对细胞的毒性作用亦不相同[23]。在体外实验中含药血清的添加量也呈现多样化,故在确定体外实验中含药血清的添加量时除参考相关文献外,预实验结果也可对选择合适的添加量进行下一步实验做出指导。原则上既要关注高浓度血清对细胞的毒性,也应考虑使含药血清的浓度尽量接近于血药浓度[24]。
设立空白血清作为对照组是为了避免血清本身具有的活性给实验结果带来影响[25]。在设立对照组时,当用一种药物剂量(如用某中药复方高剂量)给大鼠灌胃获得的含药血清,而采用不同体积分别作为不同剂量组时,对照组则应选择相应的不同体积空白血清,且在数据处理时应以实际测得数据表示;当用不同剂量的药物(如用某中药复方高、中、低剂量)给予大鼠灌胃获得的含药血清时,应取同体积的血清作为不同药物剂量组,则对照组仅需设立一组等体积空白血清[26]。总之,正确选择含药血清的添加量和设定对照组将直接关系到后续实验的结果。课题组在进行中药含药血清制备时是采用中药复方汤剂高、中、低剂量给大鼠灌胃,在设立空白血清作为对照组时用一组等体积空白血清。 3 小结
综上,应用中药含药血清进行体外实验的方法是可行的,但仍需要深入探索和研究。在对中药及复方进行研究时,建议结合血清药理学实验和中药血清药物化学的研究结果,参考给药后入血成分数和量的变化规律来严格制订合理的给药及采血方案,并依据血清色谱指纹图选择适当的方法去除血清中固有成分及内源性杂质等[27]。随着对含药血清成份分离和分析手段的提高,中药血清药理学研究将会得到进一步的发展和完善,因含药血清成分复杂致实验结果重复性差的问题将会得到逐步解决[28]。细节决定成败,有时候看似极其微小的细节问题却可能会影响到总体的结局。所以,在整个中药含药血清制备的全过程,一定要关注到每一个细节,以严谨求实的态度认真对待实验中的各个环节,从而使制备的中药含药血清最大限度的模拟真实临床状态。
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(收稿日期:2021-05-09)