角膜损伤修复过程中细胞外基质(ECM)纤维化是角膜瘢痕形成的基础，转化生长因子-β₁(TGF-β₁)可引起角膜基质过度产生ECM。我们在前期的研究工作中构建了角膜基质三维培养模型，而将TGF-β₁添加于该三维培养体系中是否可达到构建角膜基质ECM纤维化的体外三维培养模型有待研究。

评估TGF-β₁对该三维培养模型中ECM纤维化相关基因表达的影响，确定该三维培养体系是否可以作为角膜基质ECM纤维化的体外三维培养候选模型。

分离新鲜成年牛角膜，并在基础培养液(DMEM/F12＋体积分数10%胎牛血清)中进行角膜基质细胞的培养，将5×10⁵个牛角膜基质细胞收集于15 ml离心管中构建体外三维培养模型(Pellet)，根据培养液中添加的TGF-β₁质量浓度的不同分为基础培养液组(无TGF-β₁)、基础培养液＋0.5 ng/ml TGF-β₁组和基础培养液＋1.0 ng/ml TGF-β₁组，于培养2周时用钙黄绿素-AM/碘化丙啶法(Calcein-AM/PI)法进行细胞活性测定；分别于培养后48 h、1周和2周应用实时荧光定量PCR(real-time PCR)和Western blot法检测各组Pellet中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)、Col Ⅲ mRNA及其蛋白的表达。

Pellet模型培养后48 h，角膜基质细胞开始抱团，培养后2周经Calcein AM/PI染色证实绝大多数细胞存活。培养后48 h、1周和2周，基础培养液＋0.5 ng/ml TGF-β₁组和基础培养液＋1.0 ng/ml TGF-β₁组角膜基质细胞中α-SMA、Col Ⅰ和Col Ⅲ mRNA的相对表达量均明显高于基础培养液组，3个组间的总体差异均有统计学意义(F_分组＝696.745，P<0.001；F_分组＝35.166，P<0.001；F_分组＝33.677，P<0.001)，且随着培养时间的延长，α-SMA、Col Ⅰ和Col Ⅲ mRNA的相对表达量逐渐升高，差异均有统计学意义(F_时间＝5.863，P<0.05；F_时间＝298.614，P<0.001；F_时间＝607.472，P<0.001)；Col Ⅲ mRNA合成速率均大于Col Ⅰ mRNA的合成速率；Western blot检测发现，培养后48 h和1周α-SMA、Col Ⅰ和Col Ⅲ蛋白的表达量为微量，培养后2周基础培养液＋0.5 ng/ml TGF-β₁组Pellet模型中α-SMA、Col Ⅰ和Col Ⅲ蛋白的相对灰度表达量分别为0.395±0.208、1.060±0.175和0.629±0.382，基础培养液＋1.0 ng/ml TGF-β₁组α-SMA、Col Ⅰ和Col Ⅲ蛋白的灰度表达量分别为0.758±0.228、1.201±0.187和0.753±0.468，组间总体比较差异均有统计学意义(α-SMA：F＝10.691，P<0.05；Col Ⅰ：F＝14.094，P<0.05；Col Ⅲ：F＝10.995，P<0.05)。

培养液中添加TGF-β₁和血清促进角膜ECM的纤维化，表现为Pellet三维培养模型中牛角膜基质细胞高表达纤维化特异性标志物。该培养体系可作为角膜基质ECM纤维化研究的体外三维培养模型。