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摘要：提取山药零余子中的多糖，探讨其体外抗氧化活性和对糖尿病小鼠的降血糖作用。结果表明，山药零余子多糖的还原力随着浓度的提高显著增强，对DPPH·和·OH具有较强的清除能力，并呈一定的剂量关系，4.0 mg/mL剂量时清除率分别可达到91.15%和89.06%；山药零余子多糖能显著降低造模小鼠的血糖，且大剂量的山药零余子多糖降糖更明显。山药零余子多糖具有较好的抗氧化性和降血糖作用，这为安全天然食品抗氧化剂、降血糖药剂的开发提供了新来源。
关键词：山药零余子；多糖；抗氧化活性；降血糖作用
中图分类号： R284.1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0273-02
山药零余子为薯蓣科多年生草质藤本植物薯蓣（Dioscorea opposite Thunb.）叶腋间的珠芽[1]，俗称“山药蛋”，呈卵圆形或椭圆形，直径0.4～2.0 cm；外表皮淡黄色，有细皱纹；顶端中间略有茎痕，质坚硬；断面灰白色至灰褐色，气味淡而不苦，口嚼黏腻；主要含淀粉、多糖（包括黏液质及糖蛋白）、蛋白质、多种游离氨基酸等有效成分[2]，是药用价值很高的药材，可食用，具医疗价值[3]。山药零余子资源很丰富，产量可达3 000～6 000 kg/hm2，除了少部分煮食和作为繁殖材料外，大部分作为废弃物被抛弃。为进一步提高零余子的开发利用价值，提高山药产业的附加值，对山药零余子多糖抗氧化活性及对糖尿病小鼠降血糖作用进行研究，以期为山药零余子的综合开发利用奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
供试山药零余子，购于河南省焦作市；ICR小鼠，SPF级，体重20～25 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 山药零余子多糖 山药零余子粉碎后于60～80 ℃热水提取5 h，收集提取液，减压浓缩至适当体积，按Sevag法去除蛋白，再用乙醇沉淀为粗品多糖。
1.2.2 试验动物造模及分组处理 ICR雄性小鼠80只，在试验环境中适应4 d后禁食12 h，经腹腔一次性注射四氧嘧啶，剂量为150 rag/kg；再饲养3 d后禁食6 h，测定空腹血糖，并选择空腹血糖在10 mmol/L以上的试验小鼠作为糖尿病小鼠。
将ICR雄性小鼠分为5组，即正常对照组、糖尿病模型组和山药多糖模型组3个剂量组，每组10只小鼠。山药多糖模型组小鼠分别以10、20、30 rag/kg山药多糖灌胃，正常对照组和糖尿病模型组均灌胃等量的蒸馏水。每日1次，连续给药 30 d，分别测定小鼠不同时期的体重和空腹血糖。小鼠耐糖量检测在试验结束时进行，将空腹6 h后的小鼠，用葡萄糖以 25 g/kg 剂量灌胃处理，分别测定小鼠口服葡萄糖后0、1、2 h的血糖值[4]。
1.2.3 山药零余子多糖还原力测定 取不同浓度样品溶液2.5 mL于试管中，依次加入2.5 mL磷酸缓冲液（0.2 mol/L，pH值6.6）和2.5 mL 1%六氰合铁酸钾溶液，于50 ℃水浴保温20 min后，快速冷却，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，混匀，5 000 r/min离心10 min；移取上清液2.5 mL于试管中，依次加入2.5 mL蒸馏水、0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液，充分混匀，静置10 min后，以蒸馏水做参比液，在波长为700 nm处测定吸光度。吸光度越大表示还原能力越强[5]。
1.2.4 山药零余子多糖对DPPH·清除能力的测定 取样品液2 mL，加入2 mL 0.000 1 mol/L DPPH溶液（溶于95%乙醇），混匀后在室温下避光反应20 min，1 000 r/min离心 10 min，在波长为517 nm处测得吸光度为Di；空白组为2 mL样品液加入2 mL 95%乙醇溶液，517 nm处测得吸光度为Dj；对照组为2 mL DPPH溶液与2 mL蒸馏水混合，517 nm处测得吸光度为Dc，以等体积蒸馏水和95%乙醇混合液作为空白进行调零。清除率计算公式为：DPPH·清除率=[1-（Di-Dj）/Dc]×100%[6]。
1.2.5 山药零余子多糖对对·OH清除能力的测定 样品组试管中依次加入pH值为7.4的0.4 mol/L磷酸缓冲液、 2.5 mmol/L 邻二氮菲溶液、样品液、2.5 mmol/L硫酸亚铁溶液各1 mL，0.02 mol/L H2O2 0.5 mL；损伤组中用1 mL蒸馏水代替样品液；空白组中用1.5 mL蒸馏水代替样品液和H2O2溶液。37 ℃恒温水浴反应l h，快速测定536 nm处的吸光度[7]。样品对·OH的清除率计算公式为：·OH清除率=（D0-D2）/（D1-D2）×100%。其中，D0为加入样品液和H2O2的 ·OH 体系吸光度；D1为加样品液而不加H2O2的 ·OH 体系吸光度；D2为加H2O2不加样品液的·OH体系吸光度。
1.2.6 血糖测定 采集试验小鼠眼眶内眦静脉血，空腹血糖采集禁食6 h后的小鼠静脉血。取血清用葡萄糖氧化酶-过氧化酶法测定血糖。
1.2.7 数据分析 试验数据用“平均值±标准差”表示，以Minitab 16 统计软件进行单因子方差分析，采用邓肯氏新复极差法进行各组间比较。
2 结果与分析
2.1 山药零余子多糖的还原能力
还原力是物质抗氧化能力的一个重要指标，还原力强弱是多糖抗氧化性的重要参数。山药零余子多糖样品在 700 nm 处吸光度的高低，可以间接反映多糖抗氧化能力的大小。由图1可知，随着山药零余子多糖试验样品浓度升高，吸光度逐渐增加，多糖还原力也呈增加趋势；多糖浓度为 5 mg/mL 时，吸光度最高，还原力最强。
2.2 山药零余子多糖对DPPH·的清除能力 由图2可知，不同浓度的山药零余子多糖对 DPPH·均有一定程度的清除作用，且随着浓度升高清除率增加；山药零余子提取物浓度为4.0 mg/mL时，对DPPH·的清除率为 9115%。回归分析表明，山药零余子多糖对DPPH·的清除效果与多糖浓度符合一元一次方程模型，其方程为y=22994x+10.242 9（r2=0.994 6）。
2.3 山药零余子多糖对·OH 的清除能力
羟基自由基是体内最活泼的氧，累积过剩时可以引起多
种病理变化，而多糖可以提供氢原子，与羟基自由基结合成水，达到清除自由基的效果。由图3可知，不同浓度山药零余子多糖对体系中产生的·OH 均有一定的清除作用，且随着山药零余子多糖浓度升高，清除效果逐渐增强；山药零余子多糖浓度为4.0 mg/mL时，对·OH的清除率达到89.06%。
2.4 山药零余子多糖对各组试验小鼠空腹血糖的影响
由表1可知，造模前，对照组、山药多糖组小鼠空腹血糖含量无显著性差异；造模后，各小组血糖含量与正常对照组差异显著；治疗后，各多糖剂量组的糖尿病小鼠血糖含量均降低，高剂量（30 mg/kg）山药多糖降糖更加明显。这说明山药零余子多糖可有效降低糖尿病小鼠的高血糖水平。
3 小结与讨论
自由基的氧化损伤与许多疾病的发病机理有关，人体通过适当摄入具有抗氧化活性的物质可以降低体内自由基水平，防止脂质过氧化。脂质过氧化与衰老密切相关，甚至诱发许多疾病[8]。本试验结果表明，山药零余子多糖具有显著的抗氧化活性，还原力强，4.0 mg/mL剂量对DPPH·和·OH的清除能力分别为91.15%和89.06%。
四氧嘧啶诱发糖尿病的机理已经清楚，它能选择性地破坏胰岛β细胞，使胰岛内的分泌细胞减少、细胞肿胀、空泡增多等，在胰岛β细胞被破坏的机制中，自由基起着至关重要的作用[9]。本研究结果表明，山药零余子多糖可明显降低四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖，这可能与增加胰岛素分泌、改善受损坏的胰岛β细胞功能及清除多余的自由基等有关。
本研究利用化学模型表明山药零余子多糖具有较强的抗氧化和降血糖作用，为以后安全有效、具营养作用的天然抗氧化剂和降血糖药剂的开发提供了新资源，这既提高了药农的收入，又将山药零余子变废为宝。
参考文献：
[1]赵 冰. 山药栽培新技术[M]. 北京：金盾出版社，1998：13.
[2]都恒青. 常用中药材品种整理和质量研究（北方篇）：第二册[M]. 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1995：1089.
[3]孙 锋，谷文英，丁霄霖. 山药粗多糖的提取工艺[J]. 食品与生物技术学报，2006，25（3）：79-83.
[4]Vogel H G. 药理学实验指南：新药发现和药理学评价[M]. 杜冠华，译.北京：科学出版社，2001：699-700.
[5]罗祖友，严奉伟，薛照辉，等. 藤茶多糖的抗氧化作用研究[J]. 食品科学，2004，25（11）：291-295.
[6]Zha X Q，Wang J H，Yang X F. Antioxidant properties of polysaccharide fractions with different molecular mass extracted with hot-water from rice brain[J]. Carbohydrate Polymers，2009，78（3）：570-575.
[7]金 鸣，蔡亚欣，李金荣，等. 邻二氮菲-Fe2+氧化法检测 H2O2/Fe2+ 产生的羟自由基[J]. 生物化学与生物物理进展，1996，23（6）：553-555.
[8]朱淑云，董 英，张海晖，等. 水飞蓟粕蛋白的酶解及其酶解物抗氧化活性研究[J]. 中国粮油学报，2011，26（2）：68-72.
[9]杨锁成，孟 杰，胥志才. 消渴康泰对大鼠实验性糖尿病防治作用的机理研究[J]. 中国中医药科技，2000，7（2）：77-78.
关键词：山药零余子；多糖；抗氧化活性；降血糖作用
中图分类号： R284.1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0273-02
山药零余子为薯蓣科多年生草质藤本植物薯蓣（Dioscorea opposite Thunb.）叶腋间的珠芽[1]，俗称“山药蛋”，呈卵圆形或椭圆形，直径0.4～2.0 cm；外表皮淡黄色，有细皱纹；顶端中间略有茎痕，质坚硬；断面灰白色至灰褐色，气味淡而不苦，口嚼黏腻；主要含淀粉、多糖（包括黏液质及糖蛋白）、蛋白质、多种游离氨基酸等有效成分[2]，是药用价值很高的药材，可食用，具医疗价值[3]。山药零余子资源很丰富，产量可达3 000～6 000 kg/hm2，除了少部分煮食和作为繁殖材料外，大部分作为废弃物被抛弃。为进一步提高零余子的开发利用价值，提高山药产业的附加值，对山药零余子多糖抗氧化活性及对糖尿病小鼠降血糖作用进行研究，以期为山药零余子的综合开发利用奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
供试山药零余子，购于河南省焦作市；ICR小鼠，SPF级，体重20～25 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 山药零余子多糖 山药零余子粉碎后于60～80 ℃热水提取5 h，收集提取液，减压浓缩至适当体积，按Sevag法去除蛋白，再用乙醇沉淀为粗品多糖。
1.2.2 试验动物造模及分组处理 ICR雄性小鼠80只，在试验环境中适应4 d后禁食12 h，经腹腔一次性注射四氧嘧啶，剂量为150 rag/kg；再饲养3 d后禁食6 h，测定空腹血糖，并选择空腹血糖在10 mmol/L以上的试验小鼠作为糖尿病小鼠。
将ICR雄性小鼠分为5组，即正常对照组、糖尿病模型组和山药多糖模型组3个剂量组，每组10只小鼠。山药多糖模型组小鼠分别以10、20、30 rag/kg山药多糖灌胃，正常对照组和糖尿病模型组均灌胃等量的蒸馏水。每日1次，连续给药 30 d，分别测定小鼠不同时期的体重和空腹血糖。小鼠耐糖量检测在试验结束时进行，将空腹6 h后的小鼠，用葡萄糖以 25 g/kg 剂量灌胃处理，分别测定小鼠口服葡萄糖后0、1、2 h的血糖值[4]。
1.2.3 山药零余子多糖还原力测定 取不同浓度样品溶液2.5 mL于试管中，依次加入2.5 mL磷酸缓冲液（0.2 mol/L，pH值6.6）和2.5 mL 1%六氰合铁酸钾溶液，于50 ℃水浴保温20 min后，快速冷却，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，混匀，5 000 r/min离心10 min；移取上清液2.5 mL于试管中，依次加入2.5 mL蒸馏水、0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液，充分混匀，静置10 min后，以蒸馏水做参比液，在波长为700 nm处测定吸光度。吸光度越大表示还原能力越强[5]。
1.2.4 山药零余子多糖对DPPH·清除能力的测定 取样品液2 mL，加入2 mL 0.000 1 mol/L DPPH溶液（溶于95%乙醇），混匀后在室温下避光反应20 min，1 000 r/min离心 10 min，在波长为517 nm处测得吸光度为Di；空白组为2 mL样品液加入2 mL 95%乙醇溶液，517 nm处测得吸光度为Dj；对照组为2 mL DPPH溶液与2 mL蒸馏水混合，517 nm处测得吸光度为Dc，以等体积蒸馏水和95%乙醇混合液作为空白进行调零。清除率计算公式为：DPPH·清除率=[1-（Di-Dj）/Dc]×100%[6]。
1.2.5 山药零余子多糖对对·OH清除能力的测定 样品组试管中依次加入pH值为7.4的0.4 mol/L磷酸缓冲液、 2.5 mmol/L 邻二氮菲溶液、样品液、2.5 mmol/L硫酸亚铁溶液各1 mL，0.02 mol/L H2O2 0.5 mL；损伤组中用1 mL蒸馏水代替样品液；空白组中用1.5 mL蒸馏水代替样品液和H2O2溶液。37 ℃恒温水浴反应l h，快速测定536 nm处的吸光度[7]。样品对·OH的清除率计算公式为：·OH清除率=（D0-D2）/（D1-D2）×100%。其中，D0为加入样品液和H2O2的 ·OH 体系吸光度；D1为加样品液而不加H2O2的 ·OH 体系吸光度；D2为加H2O2不加样品液的·OH体系吸光度。
1.2.6 血糖测定 采集试验小鼠眼眶内眦静脉血，空腹血糖采集禁食6 h后的小鼠静脉血。取血清用葡萄糖氧化酶-过氧化酶法测定血糖。
1.2.7 数据分析 试验数据用“平均值±标准差”表示，以Minitab 16 统计软件进行单因子方差分析，采用邓肯氏新复极差法进行各组间比较。
2 结果与分析
2.1 山药零余子多糖的还原能力
还原力是物质抗氧化能力的一个重要指标，还原力强弱是多糖抗氧化性的重要参数。山药零余子多糖样品在 700 nm 处吸光度的高低，可以间接反映多糖抗氧化能力的大小。由图1可知，随着山药零余子多糖试验样品浓度升高，吸光度逐渐增加，多糖还原力也呈增加趋势；多糖浓度为 5 mg/mL 时，吸光度最高，还原力最强。
2.2 山药零余子多糖对DPPH·的清除能力 由图2可知，不同浓度的山药零余子多糖对 DPPH·均有一定程度的清除作用，且随着浓度升高清除率增加；山药零余子提取物浓度为4.0 mg/mL时，对DPPH·的清除率为 9115%。回归分析表明，山药零余子多糖对DPPH·的清除效果与多糖浓度符合一元一次方程模型，其方程为y=22994x+10.242 9（r2=0.994 6）。
2.3 山药零余子多糖对·OH 的清除能力
羟基自由基是体内最活泼的氧，累积过剩时可以引起多
种病理变化，而多糖可以提供氢原子，与羟基自由基结合成水，达到清除自由基的效果。由图3可知，不同浓度山药零余子多糖对体系中产生的·OH 均有一定的清除作用，且随着山药零余子多糖浓度升高，清除效果逐渐增强；山药零余子多糖浓度为4.0 mg/mL时，对·OH的清除率达到89.06%。
2.4 山药零余子多糖对各组试验小鼠空腹血糖的影响
由表1可知，造模前，对照组、山药多糖组小鼠空腹血糖含量无显著性差异；造模后，各小组血糖含量与正常对照组差异显著；治疗后，各多糖剂量组的糖尿病小鼠血糖含量均降低，高剂量（30 mg/kg）山药多糖降糖更加明显。这说明山药零余子多糖可有效降低糖尿病小鼠的高血糖水平。
3 小结与讨论
自由基的氧化损伤与许多疾病的发病机理有关，人体通过适当摄入具有抗氧化活性的物质可以降低体内自由基水平，防止脂质过氧化。脂质过氧化与衰老密切相关，甚至诱发许多疾病[8]。本试验结果表明，山药零余子多糖具有显著的抗氧化活性，还原力强，4.0 mg/mL剂量对DPPH·和·OH的清除能力分别为91.15%和89.06%。
四氧嘧啶诱发糖尿病的机理已经清楚，它能选择性地破坏胰岛β细胞，使胰岛内的分泌细胞减少、细胞肿胀、空泡增多等，在胰岛β细胞被破坏的机制中，自由基起着至关重要的作用[9]。本研究结果表明，山药零余子多糖可明显降低四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖，这可能与增加胰岛素分泌、改善受损坏的胰岛β细胞功能及清除多余的自由基等有关。
本研究利用化学模型表明山药零余子多糖具有较强的抗氧化和降血糖作用，为以后安全有效、具营养作用的天然抗氧化剂和降血糖药剂的开发提供了新资源，这既提高了药农的收入，又将山药零余子变废为宝。
参考文献：
[1]赵 冰. 山药栽培新技术[M]. 北京：金盾出版社，1998：13.
[2]都恒青. 常用中药材品种整理和质量研究（北方篇）：第二册[M]. 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1995：1089.
[3]孙 锋，谷文英，丁霄霖. 山药粗多糖的提取工艺[J]. 食品与生物技术学报，2006，25（3）：79-83.
[4]Vogel H G. 药理学实验指南：新药发现和药理学评价[M]. 杜冠华，译.北京：科学出版社，2001：699-700.
[5]罗祖友，严奉伟，薛照辉，等. 藤茶多糖的抗氧化作用研究[J]. 食品科学，2004，25（11）：291-295.
[6]Zha X Q，Wang J H，Yang X F. Antioxidant properties of polysaccharide fractions with different molecular mass extracted with hot-water from rice brain[J]. Carbohydrate Polymers，2009，78（3）：570-575.
[7]金 鸣，蔡亚欣，李金荣，等. 邻二氮菲-Fe2+氧化法检测 H2O2/Fe2+ 产生的羟自由基[J]. 生物化学与生物物理进展，1996，23（6）：553-555.
[8]朱淑云，董 英，张海晖，等. 水飞蓟粕蛋白的酶解及其酶解物抗氧化活性研究[J]. 中国粮油学报，2011，26（2）：68-72.
[9]杨锁成，孟 杰，胥志才. 消渴康泰对大鼠实验性糖尿病防治作用的机理研究[J]. 中国中医药科技，2000，7（2）：77-78.