【摘 要】
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目的:从临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中克隆氨基糖苷类抗生素磷酸化酶基因并异源表达,建立其磷酸化反应的体外测活方法。方法:考察临床分离MRSA对氨基糖苷类抗
【机 构】
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上海医药工业研究院创新药物与制药工艺国家重点实验室,华东理工大学生物工程学院
【基金项目】
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国家自然科学基金资助项目(No.30801449);国家“重大新药创制”科技重大专项资助项目(No.2009ZX09301-007);上海市自然科学基金资助项目(No.09ZR1430800)~~
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目的:从临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中克隆氨基糖苷类抗生素磷酸化酶基因并异源表达,建立其磷酸化反应的体外测活方法。方法:考察临床分离MRSA对氨基糖苷类抗生素的敏感性,从中克隆磷酸化酶基因,并连入pET28a构建表达载体和菌株,将表达的重组蛋白以亲和色谱分离纯化;使用ESI-MS以及抗菌活性实验测定其磷酸化酶活性。结果:药敏实验表明临床分离的6株MRSA均对氨基糖苷类抗生素不敏感,重组表达克隆到的磷酸化酶,表达产物纯化后的纯度大于90%,体外催化试验表明,重组磷酸化酶2h内可以催化反应体系内的卡那霉素B完全磷酸化。结论:异源表达的氨基糖苷类抗生素磷酸化酶具有很好的活性,体外测活方法可靠快捷,为建立氨基糖苷类抗生素磷酸化酶抑制剂筛选模型打下基础。
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