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摘要：为探索一种简单、准确、实用的活菌计数方法，通过分光光度计和平板计数法测定地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌4种菌的菌液吸光度和菌液浓度，并建立两者的线性相关关系。将4种菌接种于营养肉汤培养基中，培养18 h，每1 h取样1次，每个样品设3个平行。采用分光光度计（λ=600 nm）测定菌液吸光度（D值），同时采用10倍系列稀释法测定平皿菌落个数（CFU）。建立地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌指数期CFU（y）与D值（x）的回归方程，分别为y=31.89x 0.561、y=17.71x-0.507、y=18.09x-0.708、y=15.12x-0.270。4种菌稳定期的菌液浓度分别约为54×108、29×108、30×108、25×108 CFU/mL。
关键词：分光光度计法；有益菌；活菌数；吸光度；回归方程
中图分类号： S816.73 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0274-02
微生态制剂（microecologics）即动物食入后在消化道中生长、发育或繁殖的活体微生物饲料添加剂，具有增强免疫、提高营养的作用，主要包括植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、肠球菌、酵母菌等。微生态制剂具有防治消化道疾病、降低幼畜死亡率、提高饲料利用率、促进动物生长等作用，并具有无毒副作用、无残留、不产生抗性等优点，可作为安全性较好的饲料添加剂[1]。由于微生物个体较小，测量微生物生长应测量群体的增加量而不是细胞个体大小[2]，从而导致其添加量不易控制。在生产应用中，因添加量过多导致动物患病、添加量不足导致效果不佳的现象时有发生，影响了养殖业使用微生态制剂的积极性。
本研究探索一种实用方法来判断微生物各阶段的数量，建立快速、简单、准确的细菌浓度测定方法，以便养殖场合理使用微生态制剂。
1 材料与方法
1.1 供试菌种
粪肠球菌（Enterococcus faecalis）购自国家菌种保藏中心，编号为29212。屎肠球菌（Enterococcus faecium）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）均由河南省发酵工程实验教学示范中心分离，由南京市金斯瑞生物科技有限公司测序鉴定。
1.2 试验方法
1.2.1 种子液的培养 将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌4种菌的单个菌落接种于装有5 mL营养肉汤的试管中，置于HWS-250型培养箱，于37 ℃下恒温培养18 h。
1.2.2 菌液D值的测定 分别将2 mL地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌培养所得种子液接种于 98 mL 营养肉汤中，摇匀后置于37 ℃下恒温振荡培养18 h。采用721G型可见分光光度计（λ=600 nm）测定4种菌液的D值，每1 h测定1次。
1.2.3 平皿菌落个数的测定 采用平板计数法测定平皿菌落个数。无菌操作取1 mL菌液加入装有9 mL已灭菌生理盐水的试管中，混匀后再取1 mL加入下一支试管中，重复以上操作将菌液稀释至10-1、10-2、……、10-9不同的稀释度。采用移液枪取200 μL菌液涂布于平板，每个稀释度涂布3个平板作为平行对照。置于37 ℃下恒温静置培养12 h后，采用菌落计数法进行计数。
1.2.4 菌液浓度与吸光度关系的建立 以菌落浓度为纵坐标、D值为横坐标建立4种菌生长曲线，并采用Excel 2007软件计算生成趋势线，获得回归方程及其相关系数[3]。
2 结果与分析
2.1 生长周期的测定
测定地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌18 h内的D值，利用Excel 2007软件绘制细菌的生长趋势曲线（图1）。
由测得的D值并结合图1可得出以营养肉汤为培养基，于pH值7.2、温度37 ℃条件下生长时，细菌延滞期（lag phase）、指数期（exponential phase）、稳定期（slationary phase）、衰亡期（decline phase）时间与D值的关系（表1）。
2.2 4种菌指数期浓度与D值的关系
采用Excel 2007软件处理分析地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌4种菌液指数期D值与活菌数的线性回归方程及相关性系数，绘制4种菌的活菌数与D值之间的线性关系。由图2可知，4种菌的CFU与相应D值线性相关。
由于细菌达到稳定期时活菌数基本保持不变，对稳定期的菌液进行抽检。经实际测定，稳定期的活菌数基本符合指数期活菌数的计算公式（表2）。
3 结论与讨论
3.1 有益菌添加量的重要性
地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌4种有益菌在生长过程中消耗畜禽胃肠道内的氧气，造成厌氧环境，促进有益菌群的繁殖；同时增加肠道内酸度，抑制病原菌（沙门氏菌、志贺氏菌、假单胞菌）生长，减少机体内条件性致病菌的危害。另外，4种有益菌在生长过程中产生多种营养物质和消化酶，为机体提供营养物质，改善动物消化道微生态平衡，修复强化肠道黏膜；降低血液和肠道中氨的浓度，并减少向体外生态环境的排泄量，改善饲养环境及生态环境[4-8]。
目前，很多规模化养殖场已开始自己生产微生态制剂，但微生态制剂中每种菌的添加量均有一定标准，添加量过多或过少对动物具有极大影响。粪肠球菌添加量过多可能导致动物肠道内菌群的失衡，甚至导致动物死亡；添加量过少则使产品的功能无法达到预期效果，从而影响了微生态制剂在畜牧业生产中的推广。
3.2 菌液中活菌数与吸光度的线性关系
微生物在发酵过程中，指数期菌液的吸光度与细菌数表现为极显著的线性相关关系[9]，在本试验也可得到验证。由图2可知，在以营养肉汤为培养基的菌液中，地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌4种菌的活菌数（y）与吸光度（x）的线性回归方程分别为y=31.89x 0.561（r=0.989）、y=17.71x-0.507（r=0.987）、y=18.09x-0.708（r=0.993）、y=15.12x-0.270（r=0.995）。4种菌的相关系数r>0.874，表明以营养肉汤为培养基的4种菌液中，活菌数与吸光度的相关性极显著，两者间呈极显著的线性相关关系。可见，4种菌处于指数期的菌液活菌数可用相应的吸光度来评定。 3.3 分光光度计法的应用
生产过程中使用的有益菌多数处于稳定期和指数期。在特定培养条件下，处于稳定期的活菌数是相对恒定的（表2）。在实际生产过程中测量菌液浓度时，可通过分光光度计测量菌液的D值，再利用线性关系（表2）计算菌液中的活菌数，从而准确、便捷地判断菌液中的活菌数。
3.4 本方法与传统方法的比较
在微生态制剂中，益生菌的添加量是至关重要的因素，因此菌液中活菌数的测定显得尤为重要。目前常用的细菌计数法主要有显微镜直接计数法、平板计數法、细菌计数仪法等。
显微镜直接计数操作繁琐，且包含死菌数，对试验人员的技术操作要求高，在生产中应用较少。平板计数法和细菌计数仪法对操作人员的技术水平要求较高，检测工作量大、周期长、成本高，在生产中不便于推广。
本试验采用的分光光度计法以平板计数法为基础，借助分光光度计测定菌液的D值，达到及时掌握菌液中活菌数（实时定量）的目的。本方法采用的721G型分光光度计造价低、操作简单、准确快捷，易于在畜牧业生产中推广使用。今后养殖场制作微生态制剂时，可通过D值确定菌液中的活菌数。
参考文献：
[1]李 杰，盖士其，刘志国. 微生态制剂及其发展前景[J]. 山东畜牧兽医，2006（5）：50-53.
[2]杨柳燕，肖 琳. 环境微生物技术[M]. 北京：科学出版社，2003：36-37.
[3]高允彦. 正交及回归试验设计方法[M]. 北京：冶金工作出版社，1991.
[4]刘光辉. anpu01屎肠球菌对肉鸡生产性能和免疫效果的影响[J]. 山东畜牧兽医，2013，34（4）：14.
[5]杨晋青，梁全忠，罗惠娣，等. 日粮添加粪链球菌对山羊增质量速度的影响[J]. 山西农业科学，2012，40（6）：675-676，681.
[6]Verschuere L，Rombaut G，Sorgeloos P，et al. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews，2000，64（4）：655-671.
[7]Kim Y，Cho J Y，Kuk J H，et al. Identification and antimicrobial activity of phenylacetic acid produced by Bacillus licheniformis isolated from fermented soybean，Chungkook-Jang[J]. Current Microbiology，2004，48（4）：312-317.
[8]Cavazzoni V. Adami and castrovilli performance of broiler chickens supplemented with bacillus coagulans as probiotic[J]. Br Poultry Sci，1998，39：526-529.
[9]严佩峰，张孔海，李建芳. 乳酸菌培养液中活菌数与吸光度的关系研究[J]. 信阳农业高等专科学校学报，2012，22（1）：110-112.
关键词：分光光度计法；有益菌；活菌数；吸光度；回归方程
中图分类号： S816.73 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0274-02
微生态制剂（microecologics）即动物食入后在消化道中生长、发育或繁殖的活体微生物饲料添加剂，具有增强免疫、提高营养的作用，主要包括植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、肠球菌、酵母菌等。微生态制剂具有防治消化道疾病、降低幼畜死亡率、提高饲料利用率、促进动物生长等作用，并具有无毒副作用、无残留、不产生抗性等优点，可作为安全性较好的饲料添加剂[1]。由于微生物个体较小，测量微生物生长应测量群体的增加量而不是细胞个体大小[2]，从而导致其添加量不易控制。在生产应用中，因添加量过多导致动物患病、添加量不足导致效果不佳的现象时有发生，影响了养殖业使用微生态制剂的积极性。
本研究探索一种实用方法来判断微生物各阶段的数量，建立快速、简单、准确的细菌浓度测定方法，以便养殖场合理使用微生态制剂。
1 材料与方法
1.1 供试菌种
粪肠球菌（Enterococcus faecalis）购自国家菌种保藏中心，编号为29212。屎肠球菌（Enterococcus faecium）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）均由河南省发酵工程实验教学示范中心分离，由南京市金斯瑞生物科技有限公司测序鉴定。
1.2 试验方法
1.2.1 种子液的培养 将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌4种菌的单个菌落接种于装有5 mL营养肉汤的试管中，置于HWS-250型培养箱，于37 ℃下恒温培养18 h。
1.2.2 菌液D值的测定 分别将2 mL地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌培养所得种子液接种于 98 mL 营养肉汤中，摇匀后置于37 ℃下恒温振荡培养18 h。采用721G型可见分光光度计（λ=600 nm）测定4种菌液的D值，每1 h测定1次。
1.2.3 平皿菌落个数的测定 采用平板计数法测定平皿菌落个数。无菌操作取1 mL菌液加入装有9 mL已灭菌生理盐水的试管中，混匀后再取1 mL加入下一支试管中，重复以上操作将菌液稀释至10-1、10-2、……、10-9不同的稀释度。采用移液枪取200 μL菌液涂布于平板，每个稀释度涂布3个平板作为平行对照。置于37 ℃下恒温静置培养12 h后，采用菌落计数法进行计数。
1.2.4 菌液浓度与吸光度关系的建立 以菌落浓度为纵坐标、D值为横坐标建立4种菌生长曲线，并采用Excel 2007软件计算生成趋势线，获得回归方程及其相关系数[3]。
2 结果与分析
2.1 生长周期的测定
测定地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌18 h内的D值，利用Excel 2007软件绘制细菌的生长趋势曲线（图1）。
由测得的D值并结合图1可得出以营养肉汤为培养基，于pH值7.2、温度37 ℃条件下生长时，细菌延滞期（lag phase）、指数期（exponential phase）、稳定期（slationary phase）、衰亡期（decline phase）时间与D值的关系（表1）。
2.2 4种菌指数期浓度与D值的关系
采用Excel 2007软件处理分析地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌4种菌液指数期D值与活菌数的线性回归方程及相关性系数，绘制4种菌的活菌数与D值之间的线性关系。由图2可知，4种菌的CFU与相应D值线性相关。
由于细菌达到稳定期时活菌数基本保持不变，对稳定期的菌液进行抽检。经实际测定，稳定期的活菌数基本符合指数期活菌数的计算公式（表2）。
3 结论与讨论
3.1 有益菌添加量的重要性
地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌4种有益菌在生长过程中消耗畜禽胃肠道内的氧气，造成厌氧环境，促进有益菌群的繁殖；同时增加肠道内酸度，抑制病原菌（沙门氏菌、志贺氏菌、假单胞菌）生长，减少机体内条件性致病菌的危害。另外，4种有益菌在生长过程中产生多种营养物质和消化酶，为机体提供营养物质，改善动物消化道微生态平衡，修复强化肠道黏膜；降低血液和肠道中氨的浓度，并减少向体外生态环境的排泄量，改善饲养环境及生态环境[4-8]。
目前，很多规模化养殖场已开始自己生产微生态制剂，但微生态制剂中每种菌的添加量均有一定标准，添加量过多或过少对动物具有极大影响。粪肠球菌添加量过多可能导致动物肠道内菌群的失衡，甚至导致动物死亡；添加量过少则使产品的功能无法达到预期效果，从而影响了微生态制剂在畜牧业生产中的推广。
3.2 菌液中活菌数与吸光度的线性关系
微生物在发酵过程中，指数期菌液的吸光度与细菌数表现为极显著的线性相关关系[9]，在本试验也可得到验证。由图2可知，在以营养肉汤为培养基的菌液中，地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌4种菌的活菌数（y）与吸光度（x）的线性回归方程分别为y=31.89x 0.561（r=0.989）、y=17.71x-0.507（r=0.987）、y=18.09x-0.708（r=0.993）、y=15.12x-0.270（r=0.995）。4种菌的相关系数r>0.874，表明以营养肉汤为培养基的4种菌液中，活菌数与吸光度的相关性极显著，两者间呈极显著的线性相关关系。可见，4种菌处于指数期的菌液活菌数可用相应的吸光度来评定。 3.3 分光光度计法的应用
生产过程中使用的有益菌多数处于稳定期和指数期。在特定培养条件下，处于稳定期的活菌数是相对恒定的（表2）。在实际生产过程中测量菌液浓度时，可通过分光光度计测量菌液的D值，再利用线性关系（表2）计算菌液中的活菌数，从而准确、便捷地判断菌液中的活菌数。
3.4 本方法与传统方法的比较
在微生态制剂中，益生菌的添加量是至关重要的因素，因此菌液中活菌数的测定显得尤为重要。目前常用的细菌计数法主要有显微镜直接计数法、平板计數法、细菌计数仪法等。
显微镜直接计数操作繁琐，且包含死菌数，对试验人员的技术操作要求高，在生产中应用较少。平板计数法和细菌计数仪法对操作人员的技术水平要求较高，检测工作量大、周期长、成本高，在生产中不便于推广。
本试验采用的分光光度计法以平板计数法为基础，借助分光光度计测定菌液的D值，达到及时掌握菌液中活菌数（实时定量）的目的。本方法采用的721G型分光光度计造价低、操作简单、准确快捷，易于在畜牧业生产中推广使用。今后养殖场制作微生态制剂时，可通过D值确定菌液中的活菌数。
参考文献：
[1]李 杰，盖士其，刘志国. 微生态制剂及其发展前景[J]. 山东畜牧兽医，2006（5）：50-53.
[2]杨柳燕，肖 琳. 环境微生物技术[M]. 北京：科学出版社，2003：36-37.
[3]高允彦. 正交及回归试验设计方法[M]. 北京：冶金工作出版社，1991.
[4]刘光辉. anpu01屎肠球菌对肉鸡生产性能和免疫效果的影响[J]. 山东畜牧兽医，2013，34（4）：14.
[5]杨晋青，梁全忠，罗惠娣，等. 日粮添加粪链球菌对山羊增质量速度的影响[J]. 山西农业科学，2012，40（6）：675-676，681.
[6]Verschuere L，Rombaut G，Sorgeloos P，et al. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews，2000，64（4）：655-671.
[7]Kim Y，Cho J Y，Kuk J H，et al. Identification and antimicrobial activity of phenylacetic acid produced by Bacillus licheniformis isolated from fermented soybean，Chungkook-Jang[J]. Current Microbiology，2004，48（4）：312-317.
[8]Cavazzoni V. Adami and castrovilli performance of broiler chickens supplemented with bacillus coagulans as probiotic[J]. Br Poultry Sci，1998，39：526-529.
[9]严佩峰，张孔海，李建芳. 乳酸菌培养液中活菌数与吸光度的关系研究[J]. 信阳农业高等专科学校学报，2012，22（1）：110-112.