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摘要 AP2基因作为一种调控植物花发育的功能基因，参与花分生特性建立。利用生物信息学方法对阿拉伯岩芥AP2蛋白的理化性质、高级结构和系统进化关系等进行了详细的预测和分析。结果表明，除了成员AA40G00375、AA54G00162为稳定蛋白，其余AP2蛋白均为不稳定蛋白，且大多数蛋白定位在细胞核。只有成员AA8G00350属于分泌蛋白，其余均为非分泌蛋白，且均不属于跨膜蛋白。磷酸化位点分析表明AP2蛋白的生物功能主要是通过在丝氨酸（Ser）位点进行磷酸化来实现的。AP2蛋白的二级结构以无规则卷曲为主，各个成员的二级结构元件组成含量大小排列顺序为无规则卷曲>α-螺旋>延伸链>β-转角。其中14个AP2蛋白成员有2个保守结构域，其余均有1个保守结构域。系统进化树表明阿拉伯岩芥AP2基因家族与拟南芥、小麦有较近的亲缘关系。这些结果可为进一步研究其生物学功能提供一定的参考依据。
关键词 阿拉伯岩芥;AP2基因;生物信息学
Abstract AP2 gene，as a functional gene regulating plant flower development，is involved in the establishment of floral meristems.The physicochemical properties，advanced structure and phylogenetic relationship of AP2 proteins from Aethionema arabicum were predicted and analyzed in detail by bioinformatics.The study shows that apart from the stable proteins AA40G00375 and AA54G00162，the other AP2 proteins are unstable，and most of them were located in the nuclear.Only member AA8G00350 belongs to secretory proteins，the rest are nonsecretory proteins，and they are not transmembrane proteins.Analysis of phosphorylation sites shows that the biological function of AP2 protein is mainly achieved by phosphorylation of serine （Ser） site.The secondary structure of AP2 protein is dominated by random coil，and the content of secondary structural elements of each member is presented in the order of random coil > alpha helix > extended strand > beta turn.Fourteen members of AP2 protein have two conserved domains，and the rest have one conserved domain.Phylogenetic tree shows that AP2 gene family of A.arabicum is closely related to that of Arabidopsis thaliana，Triticum urartu.These results provides some references for further study of its biological function.
Key words Aethionema arabicum;AP2 gene;Bioinformatics
阿拉伯岩芥（Aethionema arabicum）是十字花科巖芥菜属半灌木植物，短周期，快速开花的一年生植物，较适合生长在砂质土壤中，喜热植物[1-2]。阿拉伯岩芥是在4—6月完成其生命周期，在陡峭的上坡上缺少植被覆盖，阿拉伯岩芥可以承受强紫外线的照射，在炎热的夏季，寒冷的冬季它都可以比其他植物表现更好，具有耐旱和耐寒的特点[3-4]。果实异形性被定义为同一花序上产生的果实和种子的大小、颜色、形状、休眠与萌发都不同[5]。短周期和异态表型可能是其适应不可测的本地环境的增长趋势[5]。GLS是十字花科植物中防御病原体和食草动物的一套新的代谢产物，除了它们的防御功能，GLS也可以作为引诱剂，通常用于芥末味和抗癌基因活性研究，对于增加十字花科植物的多样性有一定的价值[6]。
在植物的体内存在大量的转录因子[7]，转录因子（transcription factor）指能够与基因启动子区的顺式作用元件（Cis-acting element）相互作用，进而激活或抑制目标基因转录的一类蛋白，也被称为反式作用因子[8]。转录因子不仅在植物的生长发育、形态建成等方面发挥着重要作用，而且在植物抗逆性及次生代谢等方面也起着重要的调控作用。转录因子根据其DNA结构域的不同，被划分为bZIP、MYB、AP2/EREBP、WRKY和NAC等几个大家族[9-10]。作为植物最大转录因子家族之一，AP2/EREBP转录因子广泛存在于植物中。AP2/EREBP家族又被分为5个亚族：AP2、ERF、RAV、CBF/DREB和Soloist [11-12]。AP2转录因子家族成员至少含有一段60个左右氨基酸构成的AP2保守结构域[13-14]，除了在拟南芥、水稻、玉米和番茄等植物中，还在蓝藻、线虫和病毒中也发现了具有AP2结构域和位点特异核酸内切酶的蛋白。所以有人认为当今植物中的AP2基因起源于细菌或者病毒基因的横向转移，AP2结构域可能来自后来进化为叶绿体的原始蓝细菌的内共生[15]。AP2转录因子可通过响应乙烯、赤霉素、脱落酸、细胞分裂素和生长素的调节[16-24]，直接或间接参与种子发育过程、花和果实等器官的形态建成等植物发育的多个进程[25-26];除了初生代谢，AP2转录因子还在植物次生代谢尤其是在调控药用植物主要药用活性成分（如青蒿素、紫杉醇和木质素）合成方面效果显著[27]。同时，有报道称拟南芥AP2基因具有正向调节抗灰霉病的功能，AP2基因在植物应对高盐、干旱、缺氧、低温等非生物胁迫方面具重要功能，为植物的耐受性研究提供新契机[28-37]。 鲜见关于阿拉伯岩芥AP2基因家族生物信息学方面的报道。该研究利用生物信息学方法对阿拉伯岩芥AP2基因编码的蛋白质进行分析，预测蛋白的理化性质、亚细胞定位、保守结构域、亲水性/疏水性、信号肽、跨膜结构域、磷酸化修饰、二级结构、三级结构和系统进化等，以期为进一步研究阿拉伯岩芥AP2的生物学功能以及调节机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
通过植物转录因子数据库（PlantTFDB http：∥planttfdb.cbi.pku.edu.cn/index.php），查找并下载所有关于阿拉伯岩芥AP2基因蛋白序列和拟南芥AP2基因蛋白序列，以及二穗短柄草（Brachypodium distachyon）AP2家族成员Bradi4g30617.1.p，玉米（Zea mays）AP2家族成员GRMZM2G141219_P02，小麦（Triticum urartu）AP2家族成员Traes_5BL_B6C71B544.1，印度水稻（Oryza sativa subsp. Indica）AP2家族成员BGIOSGA030783-PA，甘蓝（Brassica oleracea）AP2家族成员XP_013638688.1，白菜（Brassica rapa）AP2家族成员XP_009149048.1的蛋白序列，用于后续的生物信息学分析。
1.2 方法
1.2.1 理化性质分析及亚细胞定位。
应用在线工具软件ExPASy-ProtParam tool （https：∥web.expasy.org/protparam/）对阿拉伯岩芥AP2基因编码蛋白进行氨基酸数、分子量、等电点（pI）等理化性质的分析;利用在线软件CELLO v.2.（http：∥cello.life.nctu.edu.tw/cgi/main.cgi）进行亚细胞定位预测[38-46]。
1.2.2 信号肽和跨膜结构域预测。
利用SignalP3.0Server （http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）预测分析蛋白是否存在信号肽，是否属于分泌蛋白;利用TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/#opennewwindow）对其进行跨膜结构域预测分析[47-52]。
1.2.3 磷酸化位点预测、亲疏水性及保守结构预测。
用NetPhos3.1Server（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）进行磷酸化预测，以进一步了解目标蛋白的细胞生理活动及调控机制;利用在线软件ExPASy-ProtScale （https：∥web.expasy.org/protscale/）进行亲水性/疏水性分析;使用NCBI Conserved Domain Search （https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）预测保守结构域，探究其结构域特点[53-58]。
1.2.4 二级结构和三级结构预测分析。
二级结构的预测利用NPS@ SOPMA secondary structure prediction （https：∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）;利用PHYRE2 Protein Fold Recognition Server （http：∥www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/page.cgi？id=index）进行三级结构预测，通过两者预测以了解蛋白质的结構组成[59-63]。
1.2.5 保守基序和系统进化树建构。
利用Mega7.0软件中Neighbor-Joining方法构建进化树，其中进行1 000次Bootstrap分析，以使得分枝的结果更加全面可靠;利用MEME 4.12.0 （http：∥memesuite.org/tools/meme）分析保守基序。以此对基因的亲缘关系进行探究[64-70]。
2 结果与分析
2.1 阿拉伯岩芥AP2基因编码蛋白的理化性质分析及亚细胞定位
对阿拉伯岩芥AP2基因编码蛋白的理化性质进行分析，在AP2基因编码蛋白中只有AA386G00002和AA91G00006的氨基酸数目相同，为307 aa。AP2基因编码蛋白中最长的是AA26G00748，为578 aa;最短的是AA60G00285，为216 aa;平均长度为415.7 aa。分子量为24.821～63.181。AP2蛋白中有9个成员的等电点大于7，其余均小于7，其中最大的是AA91G00006，为9.38;最小的是AA55G00050，为5.16。说明该家族中含有大量的酸性氨基酸。20个成员中成员带负电荷的残基总数等于带正电荷的残基总数，只有AA32G00857，显示电中性;其余有11个成员的带负电荷的残基总数大于带正电荷的残基总数，显示带负电荷;有8个成员带正电荷的残基总数大于带负电荷的残基总数，显示带正电荷。不稳定系数表明AA40G00375、AA54G00162为稳定蛋白，其余均为不稳定蛋白（不稳定系数小于40的为稳定蛋白）。脂肪族氨基酸可以反映蛋白质的热稳定性，该家族脂肪族氨基酸指数分布在51.29（AA32G00857）～73.07（AA8G00350），说明该基因家族蛋白成员的热稳定性差异较大（表1）。
亚细胞定位分析表明，阿拉伯岩芥AP2蛋白有1个成员的亚细胞仅存在于细胞质，是成员AA54G00162。有2个成员（AA31G00833、AA60G00285）的亚细胞在细胞核和线粒体都有存在，还有2个成员（AA55G00050、AA8G00012）的亚细胞存在于细胞核和细胞质，其余15个成员的亚细胞都只存在于细胞核（表1）。 2.2 阿拉伯岩芥AP2基因编码蛋白的保守结构域和疏水性/亲水性预测
对阿拉伯岩芥AP2基因编码蛋白的保守结构域进行预测分析发现14个成员有2个保守结构域，有6个成员AA19G00471、AA16G00088、AA91G00006、AA8G00350、AA60G00285、AA8G00012只有1个保守结构域，除了成员AA386G00002含有保守结构域片段最短，为40个氨基酸构成的保守结构域，成员AA30G00284含有保守结构域片段较短，为53个氨基酸构成的保守结构域，其余每个成员至少含有一段60个左右的氨基酸构成的保守结构域，根据保守结构域表现形式以及数目的不同，将AP2基因编码蛋白分成5类（表2、图1）。
疏水性/亲水性分析表明AP2蛋白成员中最大疏水性数值在1.156～2.233，最大亲水性数值在-3.633～-2.467。成员AA8G00350上有最大数值2.233，成员AA44G00651上有最小数值-3.633，根据氨基酸分值越低亲水性越强和分值越高疏水性越强的规律可以看出，在成员AA44G00651上第162位赖氨酸（Lys）亲水性最强，在成员AA8G00350上第52位的苯丙氨酸（Phe）疏水性最强，而就整体而言，亲水性峰值相对疏水性峰值较多，较密集。因此，AP2蛋白表现为亲水性，可认为AP2蛋白为亲水蛋白（表3）。
2.3 阿拉伯岩芥AP2基因编码蛋白的信号肽分析
对AP2基因编码蛋白的信号肽进行预测分析发现，C值最大切割点在第24个氨基酸位置，分值为0.454，综合剪切点分值（Y值）最高值在第24个氨基酸位置，分值为0.450，信号肽最大分值（S值）在第12个氨基酸位置，为0.922，因此判断成员AA8G00350有信号肽，属于分泌性蛋白（图2）。其余成员均无信号肽，为非分泌蛋白。
2.4 阿拉伯岩芥AP2基因編码蛋白的跨膜结构域分析
对阿拉伯岩芥AP2蛋白序列的跨膜结构域分析发现该基因家族的蛋白成员AA8G00350、AA55G00050、AA91G00006有跨膜现象，尤其是成员AA8G00350可以看到从第5个氨基酸到第29个氨基酸之间有一个明显跨膜区，但是并没有形成跨膜域，所以推测成员AA8G00350不属于跨膜蛋白。其余的成员均没有跨膜区域，因此，AP2基因编码蛋白的20个成员都不属于跨膜蛋白。
2.5 阿拉伯岩芥AP2基因编码蛋白的磷酸化位点预测分析
对阿拉伯岩芥AP2基因编码蛋白的氨基酸序列的磷酸化位点分析发现，在AP2基因编码的蛋白20个成员中共含有692个丝氨酸（Ser）磷酸化位点，297个苏氨酸（Thr）磷酸化位点，93个酪氨酸（Tyr）磷酸化位点。其中成员AA32G00857丝氨酸（Ser）磷酸化位点最多，为53个，最有可能的磷酸化位点是158位的丝氨酸（Ser），数值为0.998;成员AA5G00136苏氨酸（Thr）磷酸化位点最多，为27个，最有可能的磷酸化位点是344位的丝氨酸（Ser），数值为0.997;成员AA26G00748酪氨酸（Tyr）磷酸化位点最多，为11个，最有可能的磷酸化位点是279位的丝氨酸（Ser），数值为0.997;成员AA26G00748的磷酸化位点总数最多，为81个;成员AA8G00012和AA60G00285的磷酸化位点总数最少，为29个。整体成员数据分析表明蛋白主要是通过在丝氨酸（Ser）位点进行磷酸化来实现功能的（表4）。
2.6 阿拉伯岩芥AP2基因编码蛋白的二级结构和三级结构预测分析
对阿拉伯岩芥AP2蛋白的二级结构和三级结构预测分析表明，AP2蛋白的二级结构都以无规则卷曲为主，各个成员的二级结构元件组成含量大小排列顺序都表现为无规则卷曲>α-螺旋>延伸链>β-转角。其中α-螺旋在蛋白二级结构中占比最多的是成员AA55G00050（35.66%），占比最少的是成员AA44G00651（19.60%）;延伸链在蛋白二级结构中占比最多的是成员AA60G00285（27.78%），占比最少的是成员AA37G00143（6.08%）;β-转角在蛋白二级结构中占比最多的是成员AA30G00284（8.21%）;无规则卷曲在蛋白二级结构中占比最多的是成员AA386G00002（64.82%），占比最少的是AA60G00285（41.67%）（图3）。
对阿拉伯岩芥AP2蛋白的三级结构预测分析发现，所有成员都以α-螺旋较为突出，且可分为10个组（I～X），其中Ⅳ组含有3个成员（AA16G00088、AA60G00285、AA44G00309），Ⅸ组含有1个成员（AA30G00284），其余各组均含有2个成员。三级结构中含有α-螺旋元件最多的是Ⅵ组（AA8G00012、AA31G00833）、Ⅷ组（AA54G00162、AA37G00143）、Ⅸ组（AA30G00284）、Ⅹ组（AA44G00651、AA2G00186），含有3个α-螺旋元件;最少的是Ⅰ组（AA19G00471、AA91G00006）、Ⅱ组（AA5G00136、AA30G00232）（图4）。
2.7 阿拉伯岩芥AP2基因序列结构特点
利用MEME5.0.4软件对20个阿拉伯岩芥AP2蛋白氨基酸序列进行motif查找，设置motif数目为10，其余参数为默认值。可知motif1、motif2、motif3、motif4这4种元件是普遍存在于20个成员之中的，YRG和RAYD元件都已被证实参与了DNA或其他转录因子的结合[71]。由此可知，motif1、motif2、motif3、motif4是阿拉伯岩芥AP2基因编码蛋白的重要组件。对其生命活动的调控机制起着重要的作用。由进化关系和基序特点可以将阿拉伯岩芥AP2基因编码蛋白20个成员分为7个组。第1组成员（AA16G00088、AA8G00350、AA91G00006、AA60G00285）主要含有motif1、motif2、motif3这3种元件;第2组成员（AA8G00012、AA30G00232、AA32G00857）主要含有motif1、motif3、motif5;第3组成员（AA5G00136、AA54G00162、AA386G00002、AA55G00050）主要含有motif1、motif7;第4组成员（AA19G00471、AA31G00833、AA3G00143）主要含有motif2、motif4、motif6、motif3、motif5、motif1、motif9;第5组（AA30G00284）和第6组（AA44G00309）都分别只有1个成员;第7组成员（AA40G00375、AA26G0048、AA2G00186、AA44G00651）含有motif1、motif2、motif3、motif4、motif5、motif6、motif8、motif10共8个元件，是7组中含元件数量最多的1组。这7个组的成员都高度保守，且各组成员之间基序基本一致（图5、6）。 2.8 阿拉伯岩芥AP2基因系统进化树构建
对阿拉伯芥AP2基因家族的所有蛋白成员系统发育进化关系分析表明，阿拉伯岩芥AP2蛋白家族分为7组，组 Ⅰ 有7个成员，成员数最多，组 Ⅱ 有4个成员，组Ⅲ和组Ⅵ有3个成员，其余组都只有1个成员。第Ⅶ组成员AA44G00651是最原始的一支，第 Ⅰ 组成员AA91G00006和AA60G00285是距离原始亲缘最远的一支，其进化速度最快（图7A）。
阿拉伯岩芥与拟南芥AP2蛋白的系统进化分析表明，阿拉伯岩芥与拟南芥亲缘关系很近。整体共分为7个组，组 Ⅰ 共16个基因成员，阿拉伯岩芥成员有7个，拟南芥成员有9个，其中拟南芥成员AT1G79700.1是进化速度最快的1个;阿拉伯岩芥成员AA37G00143与其处在同一地位，亲缘关系最近。组 Ⅱ 共有16个成员，阿拉伯岩芥成员有6个，拟南芥成员有10个，其中成员AT4G37750.1与成员AA30G00284、成员AA40G00375与成员AT1G51190.1、成员AA44G00651和AT5G17430.1、成员AA2G00186和AT3G20840.1、成员AA44G00309和AT5G10510.3有较近的亲缘关系，同为姊妹关系。组Ⅲ共有7个成员，阿拉伯岩芥成员有3个，拟南芥成员有4个，其中只有成员AA8G00012和AT5G67180.1的亲缘关系最近，可能为亲缘关系较近的一类蛋白。组Ⅳ共有4个成员，阿拉伯岩芥成员数量和拟南芥成员数量相等，都是2个;组Ⅴ只有1个拟南芥成员;组Ⅵ共有2个成员，阿拉伯岩芥和拟南芥成员各1个;组Ⅶ共有4个成员，阿拉伯岩芥成员只有1個，其余均为拟南芥成员，其中拟南芥成员AT2G28550.1是最原始的一支（图7B）。
阿拉伯岩芥AP2基因家族成员AA37G00143与拟南芥等多个物种AP2成员分子进化关系分析表明，阿拉伯岩芥与其他成员都有较高的亲缘关系。其中阿拉伯岩芥成员AA37G00143与拟南芥成员AT1G16060.1和小麦成员Traes-5BL-B6C71B544.1的亲缘关系最近，与印度水稻的亲缘关系最远。从十字花科分类的角度分析，阿拉伯岩芥与拟南芥亲缘关系最近，可能与其同属于十字花科有关，但是与甘蓝的亲缘关系最远;从双子叶植物与单子叶植物分类分析，阿拉伯岩芥亦是与拟南芥和小麦亲缘关系最近，然而与印度水稻的亲缘关系最远，可能与它们分别属于单双子叶植物有关（图8）。
3 讨论与结论
郭慧等[8]对甘蓝AP2/ERF转录因子的研究分析表明甘蓝AP2蛋白质结构为不稳定性蛋白。该研究中阿拉伯岩芥AP2基因编码蛋白之间存在差异性，且为不稳定蛋白，这与郭慧等[8]对甘蓝AP2蛋白结构研究结果相同。谢藤等[72]对新疆紫草AP2/ERF转录因子进行生物信息学分析表明其亚细胞定位存在于细胞核，不存在跨膜域，不属于分泌蛋白。该研究表明阿拉伯岩芥AP2蛋白亚细胞主要存在于细胞核，跨膜域分析显示所有编码蛋白都不属于跨膜蛋白，成员AA8G00350属于分泌蛋白，跨膜域分析与谢藤等[72]的研究结果相同，但亚细胞定位分析和信号肽分析结果与其不同，不同的原因可能与不同物种蛋白的结构组成存在差异性有关。赵金玲等[73]对杨树AP2/ERF基因家族性质的研究表明杨树AP2/ERF家族蛋白二级结构都以随机卷曲为主，其二级结构特点与阿拉伯岩芥AP2基因编码蛋白的二级结构特点相似，都以无规则卷曲结构为主，且阿拉伯岩芥AP2蛋白各个成员的二级结构元件组成含量大小排列顺序都表现为无规则卷曲>α-螺旋>延伸链>β-转角，模拟生成三级结构的图像与二级结构预测的结果相一致。不同物种之间其AP2家族成员数量各有不同，例如拟南芥为30个，玉米为54个，甘蓝为43个。但是不同物种之间的AP2基因具有一定的保守性，都含有特定的AP2结构域[30，71]。该研究显示阿拉伯岩芥AP2基因编码蛋白20个成员都含有AP2保守结构域，其中14个成员有2个保守结构域，其余均只有1个保守结构域。植物为了克服生长发育中不利影响，自身会在体内形成各种应答机制，有些蛋白会在非生物胁迫下作为保护因子调控植物细胞的稳定，进而提升其抗逆性[71，74]。该研究中阿拉伯岩芥AP2蛋白整体成员表现为亲水性蛋白，这可能是利于阿拉伯岩芥增强抗逆性的因素。YRG和RAYD元件都已被证实参与了DNA或其他转录因子的结合。研究证实，AP2中的一个转录因子WXP1与苜蓿和拟南芥的抗旱性都有关[71，75-77]。基因序列对比表明阿拉伯岩芥AP2基因序列含有YRG元件和RAYD元件，推测阿拉伯岩芥抗干旱功能也与其有关。庄静[78]对白菜与拟南芥进行研究分析建构进化树表明，白菜与拟南芥有较近的亲缘关系。该研究中阿拉伯岩芥与多个物种建构系统进化树表明阿拉伯岩芥AP2基因家族与拟南芥、小麦等都有较近的亲缘关系，完善了庄静[78]的系统进化分析结果。
该研究结果表明，阿拉伯岩芥AP2基因家族编码蛋白不同成员之间存在差异，其中只有成员AA40G00375、AA54G00162为稳定蛋白，其余均为不稳定蛋白，其大多数蛋白的亚细胞定位以细胞核为主，只有成员AA8G00350属于分泌蛋白，其余为非分泌蛋白，且所有蛋白为亲水性蛋白，不属于跨膜蛋白，都含有至少1个AP2结构域，通过丝氨酸位点处进行磷酸化来实现功能。其二级结构较整齐，都以无规则卷曲为主，各个成员的二级结构元件组成含量大小排列顺序都表现为无规则卷曲>α-螺旋>延伸链>β-转角，三级结构的图像与二级结构预测的结果相一致。阿拉伯岩芥AP2基因家族与拟南芥、白菜、玉米、小麦等都有较近的亲缘关系，其中阿拉伯岩芥成员AA37G00143与拟南芥成员AT1G16060.1和小麦成员Traes_5BL_B6C71B544.1的亲缘关系最近，与印度水稻的亲缘关系最远。阿拉伯岩芥与拟南芥的亲缘关系最近，可能与其同属于十字花科有关，而与印度水稻的亲缘关系最远，可能与它们分别属于单双子叶植物有关。该研究结果为进一步研究阿拉伯岩芥AP2基因家族在其生长发育过程中的生物学功能提供了一定的参考依据。 参考文献
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关键词 阿拉伯岩芥;AP2基因;生物信息学
Abstract AP2 gene，as a functional gene regulating plant flower development，is involved in the establishment of floral meristems.The physicochemical properties，advanced structure and phylogenetic relationship of AP2 proteins from Aethionema arabicum were predicted and analyzed in detail by bioinformatics.The study shows that apart from the stable proteins AA40G00375 and AA54G00162，the other AP2 proteins are unstable，and most of them were located in the nuclear.Only member AA8G00350 belongs to secretory proteins，the rest are nonsecretory proteins，and they are not transmembrane proteins.Analysis of phosphorylation sites shows that the biological function of AP2 protein is mainly achieved by phosphorylation of serine （Ser） site.The secondary structure of AP2 protein is dominated by random coil，and the content of secondary structural elements of each member is presented in the order of random coil > alpha helix > extended strand > beta turn.Fourteen members of AP2 protein have two conserved domains，and the rest have one conserved domain.Phylogenetic tree shows that AP2 gene family of A.arabicum is closely related to that of Arabidopsis thaliana，Triticum urartu.These results provides some references for further study of its biological function.
Key words Aethionema arabicum;AP2 gene;Bioinformatics
阿拉伯岩芥（Aethionema arabicum）是十字花科巖芥菜属半灌木植物，短周期，快速开花的一年生植物，较适合生长在砂质土壤中，喜热植物[1-2]。阿拉伯岩芥是在4—6月完成其生命周期，在陡峭的上坡上缺少植被覆盖，阿拉伯岩芥可以承受强紫外线的照射，在炎热的夏季，寒冷的冬季它都可以比其他植物表现更好，具有耐旱和耐寒的特点[3-4]。果实异形性被定义为同一花序上产生的果实和种子的大小、颜色、形状、休眠与萌发都不同[5]。短周期和异态表型可能是其适应不可测的本地环境的增长趋势[5]。GLS是十字花科植物中防御病原体和食草动物的一套新的代谢产物，除了它们的防御功能，GLS也可以作为引诱剂，通常用于芥末味和抗癌基因活性研究，对于增加十字花科植物的多样性有一定的价值[6]。
在植物的体内存在大量的转录因子[7]，转录因子（transcription factor）指能够与基因启动子区的顺式作用元件（Cis-acting element）相互作用，进而激活或抑制目标基因转录的一类蛋白，也被称为反式作用因子[8]。转录因子不仅在植物的生长发育、形态建成等方面发挥着重要作用，而且在植物抗逆性及次生代谢等方面也起着重要的调控作用。转录因子根据其DNA结构域的不同，被划分为bZIP、MYB、AP2/EREBP、WRKY和NAC等几个大家族[9-10]。作为植物最大转录因子家族之一，AP2/EREBP转录因子广泛存在于植物中。AP2/EREBP家族又被分为5个亚族：AP2、ERF、RAV、CBF/DREB和Soloist [11-12]。AP2转录因子家族成员至少含有一段60个左右氨基酸构成的AP2保守结构域[13-14]，除了在拟南芥、水稻、玉米和番茄等植物中，还在蓝藻、线虫和病毒中也发现了具有AP2结构域和位点特异核酸内切酶的蛋白。所以有人认为当今植物中的AP2基因起源于细菌或者病毒基因的横向转移，AP2结构域可能来自后来进化为叶绿体的原始蓝细菌的内共生[15]。AP2转录因子可通过响应乙烯、赤霉素、脱落酸、细胞分裂素和生长素的调节[16-24]，直接或间接参与种子发育过程、花和果实等器官的形态建成等植物发育的多个进程[25-26];除了初生代谢，AP2转录因子还在植物次生代谢尤其是在调控药用植物主要药用活性成分（如青蒿素、紫杉醇和木质素）合成方面效果显著[27]。同时，有报道称拟南芥AP2基因具有正向调节抗灰霉病的功能，AP2基因在植物应对高盐、干旱、缺氧、低温等非生物胁迫方面具重要功能，为植物的耐受性研究提供新契机[28-37]。 鲜见关于阿拉伯岩芥AP2基因家族生物信息学方面的报道。该研究利用生物信息学方法对阿拉伯岩芥AP2基因编码的蛋白质进行分析，预测蛋白的理化性质、亚细胞定位、保守结构域、亲水性/疏水性、信号肽、跨膜结构域、磷酸化修饰、二级结构、三级结构和系统进化等，以期为进一步研究阿拉伯岩芥AP2的生物学功能以及调节机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
通过植物转录因子数据库（PlantTFDB http：∥planttfdb.cbi.pku.edu.cn/index.php），查找并下载所有关于阿拉伯岩芥AP2基因蛋白序列和拟南芥AP2基因蛋白序列，以及二穗短柄草（Brachypodium distachyon）AP2家族成员Bradi4g30617.1.p，玉米（Zea mays）AP2家族成员GRMZM2G141219_P02，小麦（Triticum urartu）AP2家族成员Traes_5BL_B6C71B544.1，印度水稻（Oryza sativa subsp. Indica）AP2家族成员BGIOSGA030783-PA，甘蓝（Brassica oleracea）AP2家族成员XP_013638688.1，白菜（Brassica rapa）AP2家族成员XP_009149048.1的蛋白序列，用于后续的生物信息学分析。
1.2 方法
1.2.1 理化性质分析及亚细胞定位。
应用在线工具软件ExPASy-ProtParam tool （https：∥web.expasy.org/protparam/）对阿拉伯岩芥AP2基因编码蛋白进行氨基酸数、分子量、等电点（pI）等理化性质的分析;利用在线软件CELLO v.2.（http：∥cello.life.nctu.edu.tw/cgi/main.cgi）进行亚细胞定位预测[38-46]。
1.2.2 信号肽和跨膜结构域预测。
利用SignalP3.0Server （http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）预测分析蛋白是否存在信号肽，是否属于分泌蛋白;利用TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/#opennewwindow）对其进行跨膜结构域预测分析[47-52]。
1.2.3 磷酸化位点预测、亲疏水性及保守结构预测。
用NetPhos3.1Server（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）进行磷酸化预测，以进一步了解目标蛋白的细胞生理活动及调控机制;利用在线软件ExPASy-ProtScale （https：∥web.expasy.org/protscale/）进行亲水性/疏水性分析;使用NCBI Conserved Domain Search （https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）预测保守结构域，探究其结构域特点[53-58]。
1.2.4 二级结构和三级结构预测分析。
二级结构的预测利用NPS@ SOPMA secondary structure prediction （https：∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）;利用PHYRE2 Protein Fold Recognition Server （http：∥www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/page.cgi？id=index）进行三级结构预测，通过两者预测以了解蛋白质的结構组成[59-63]。
1.2.5 保守基序和系统进化树建构。
利用Mega7.0软件中Neighbor-Joining方法构建进化树，其中进行1 000次Bootstrap分析，以使得分枝的结果更加全面可靠;利用MEME 4.12.0 （http：∥memesuite.org/tools/meme）分析保守基序。以此对基因的亲缘关系进行探究[64-70]。
2 结果与分析
2.1 阿拉伯岩芥AP2基因编码蛋白的理化性质分析及亚细胞定位
对阿拉伯岩芥AP2基因编码蛋白的理化性质进行分析，在AP2基因编码蛋白中只有AA386G00002和AA91G00006的氨基酸数目相同，为307 aa。AP2基因编码蛋白中最长的是AA26G00748，为578 aa;最短的是AA60G00285，为216 aa;平均长度为415.7 aa。分子量为24.821～63.181。AP2蛋白中有9个成员的等电点大于7，其余均小于7，其中最大的是AA91G00006，为9.38;最小的是AA55G00050，为5.16。说明该家族中含有大量的酸性氨基酸。20个成员中成员带负电荷的残基总数等于带正电荷的残基总数，只有AA32G00857，显示电中性;其余有11个成员的带负电荷的残基总数大于带正电荷的残基总数，显示带负电荷;有8个成员带正电荷的残基总数大于带负电荷的残基总数，显示带正电荷。不稳定系数表明AA40G00375、AA54G00162为稳定蛋白，其余均为不稳定蛋白（不稳定系数小于40的为稳定蛋白）。脂肪族氨基酸可以反映蛋白质的热稳定性，该家族脂肪族氨基酸指数分布在51.29（AA32G00857）～73.07（AA8G00350），说明该基因家族蛋白成员的热稳定性差异较大（表1）。
亚细胞定位分析表明，阿拉伯岩芥AP2蛋白有1个成员的亚细胞仅存在于细胞质，是成员AA54G00162。有2个成员（AA31G00833、AA60G00285）的亚细胞在细胞核和线粒体都有存在，还有2个成员（AA55G00050、AA8G00012）的亚细胞存在于细胞核和细胞质，其余15个成员的亚细胞都只存在于细胞核（表1）。 2.2 阿拉伯岩芥AP2基因编码蛋白的保守结构域和疏水性/亲水性预测
对阿拉伯岩芥AP2基因编码蛋白的保守结构域进行预测分析发现14个成员有2个保守结构域，有6个成员AA19G00471、AA16G00088、AA91G00006、AA8G00350、AA60G00285、AA8G00012只有1个保守结构域，除了成员AA386G00002含有保守结构域片段最短，为40个氨基酸构成的保守结构域，成员AA30G00284含有保守结构域片段较短，为53个氨基酸构成的保守结构域，其余每个成员至少含有一段60个左右的氨基酸构成的保守结构域，根据保守结构域表现形式以及数目的不同，将AP2基因编码蛋白分成5类（表2、图1）。
疏水性/亲水性分析表明AP2蛋白成员中最大疏水性数值在1.156～2.233，最大亲水性数值在-3.633～-2.467。成员AA8G00350上有最大数值2.233，成员AA44G00651上有最小数值-3.633，根据氨基酸分值越低亲水性越强和分值越高疏水性越强的规律可以看出，在成员AA44G00651上第162位赖氨酸（Lys）亲水性最强，在成员AA8G00350上第52位的苯丙氨酸（Phe）疏水性最强，而就整体而言，亲水性峰值相对疏水性峰值较多，较密集。因此，AP2蛋白表现为亲水性，可认为AP2蛋白为亲水蛋白（表3）。
2.3 阿拉伯岩芥AP2基因编码蛋白的信号肽分析
对AP2基因编码蛋白的信号肽进行预测分析发现，C值最大切割点在第24个氨基酸位置，分值为0.454，综合剪切点分值（Y值）最高值在第24个氨基酸位置，分值为0.450，信号肽最大分值（S值）在第12个氨基酸位置，为0.922，因此判断成员AA8G00350有信号肽，属于分泌性蛋白（图2）。其余成员均无信号肽，为非分泌蛋白。
2.4 阿拉伯岩芥AP2基因編码蛋白的跨膜结构域分析
对阿拉伯岩芥AP2蛋白序列的跨膜结构域分析发现该基因家族的蛋白成员AA8G00350、AA55G00050、AA91G00006有跨膜现象，尤其是成员AA8G00350可以看到从第5个氨基酸到第29个氨基酸之间有一个明显跨膜区，但是并没有形成跨膜域，所以推测成员AA8G00350不属于跨膜蛋白。其余的成员均没有跨膜区域，因此，AP2基因编码蛋白的20个成员都不属于跨膜蛋白。
2.5 阿拉伯岩芥AP2基因编码蛋白的磷酸化位点预测分析
对阿拉伯岩芥AP2基因编码蛋白的氨基酸序列的磷酸化位点分析发现，在AP2基因编码的蛋白20个成员中共含有692个丝氨酸（Ser）磷酸化位点，297个苏氨酸（Thr）磷酸化位点，93个酪氨酸（Tyr）磷酸化位点。其中成员AA32G00857丝氨酸（Ser）磷酸化位点最多，为53个，最有可能的磷酸化位点是158位的丝氨酸（Ser），数值为0.998;成员AA5G00136苏氨酸（Thr）磷酸化位点最多，为27个，最有可能的磷酸化位点是344位的丝氨酸（Ser），数值为0.997;成员AA26G00748酪氨酸（Tyr）磷酸化位点最多，为11个，最有可能的磷酸化位点是279位的丝氨酸（Ser），数值为0.997;成员AA26G00748的磷酸化位点总数最多，为81个;成员AA8G00012和AA60G00285的磷酸化位点总数最少，为29个。整体成员数据分析表明蛋白主要是通过在丝氨酸（Ser）位点进行磷酸化来实现功能的（表4）。
2.6 阿拉伯岩芥AP2基因编码蛋白的二级结构和三级结构预测分析
对阿拉伯岩芥AP2蛋白的二级结构和三级结构预测分析表明，AP2蛋白的二级结构都以无规则卷曲为主，各个成员的二级结构元件组成含量大小排列顺序都表现为无规则卷曲>α-螺旋>延伸链>β-转角。其中α-螺旋在蛋白二级结构中占比最多的是成员AA55G00050（35.66%），占比最少的是成员AA44G00651（19.60%）;延伸链在蛋白二级结构中占比最多的是成员AA60G00285（27.78%），占比最少的是成员AA37G00143（6.08%）;β-转角在蛋白二级结构中占比最多的是成员AA30G00284（8.21%）;无规则卷曲在蛋白二级结构中占比最多的是成员AA386G00002（64.82%），占比最少的是AA60G00285（41.67%）（图3）。
对阿拉伯岩芥AP2蛋白的三级结构预测分析发现，所有成员都以α-螺旋较为突出，且可分为10个组（I～X），其中Ⅳ组含有3个成员（AA16G00088、AA60G00285、AA44G00309），Ⅸ组含有1个成员（AA30G00284），其余各组均含有2个成员。三级结构中含有α-螺旋元件最多的是Ⅵ组（AA8G00012、AA31G00833）、Ⅷ组（AA54G00162、AA37G00143）、Ⅸ组（AA30G00284）、Ⅹ组（AA44G00651、AA2G00186），含有3个α-螺旋元件;最少的是Ⅰ组（AA19G00471、AA91G00006）、Ⅱ组（AA5G00136、AA30G00232）（图4）。
2.7 阿拉伯岩芥AP2基因序列结构特点
利用MEME5.0.4软件对20个阿拉伯岩芥AP2蛋白氨基酸序列进行motif查找，设置motif数目为10，其余参数为默认值。可知motif1、motif2、motif3、motif4这4种元件是普遍存在于20个成员之中的，YRG和RAYD元件都已被证实参与了DNA或其他转录因子的结合[71]。由此可知，motif1、motif2、motif3、motif4是阿拉伯岩芥AP2基因编码蛋白的重要组件。对其生命活动的调控机制起着重要的作用。由进化关系和基序特点可以将阿拉伯岩芥AP2基因编码蛋白20个成员分为7个组。第1组成员（AA16G00088、AA8G00350、AA91G00006、AA60G00285）主要含有motif1、motif2、motif3这3种元件;第2组成员（AA8G00012、AA30G00232、AA32G00857）主要含有motif1、motif3、motif5;第3组成员（AA5G00136、AA54G00162、AA386G00002、AA55G00050）主要含有motif1、motif7;第4组成员（AA19G00471、AA31G00833、AA3G00143）主要含有motif2、motif4、motif6、motif3、motif5、motif1、motif9;第5组（AA30G00284）和第6组（AA44G00309）都分别只有1个成员;第7组成员（AA40G00375、AA26G0048、AA2G00186、AA44G00651）含有motif1、motif2、motif3、motif4、motif5、motif6、motif8、motif10共8个元件，是7组中含元件数量最多的1组。这7个组的成员都高度保守，且各组成员之间基序基本一致（图5、6）。 2.8 阿拉伯岩芥AP2基因系统进化树构建
对阿拉伯芥AP2基因家族的所有蛋白成员系统发育进化关系分析表明，阿拉伯岩芥AP2蛋白家族分为7组，组 Ⅰ 有7个成员，成员数最多，组 Ⅱ 有4个成员，组Ⅲ和组Ⅵ有3个成员，其余组都只有1个成员。第Ⅶ组成员AA44G00651是最原始的一支，第 Ⅰ 组成员AA91G00006和AA60G00285是距离原始亲缘最远的一支，其进化速度最快（图7A）。
阿拉伯岩芥与拟南芥AP2蛋白的系统进化分析表明，阿拉伯岩芥与拟南芥亲缘关系很近。整体共分为7个组，组 Ⅰ 共16个基因成员，阿拉伯岩芥成员有7个，拟南芥成员有9个，其中拟南芥成员AT1G79700.1是进化速度最快的1个;阿拉伯岩芥成员AA37G00143与其处在同一地位，亲缘关系最近。组 Ⅱ 共有16个成员，阿拉伯岩芥成员有6个，拟南芥成员有10个，其中成员AT4G37750.1与成员AA30G00284、成员AA40G00375与成员AT1G51190.1、成员AA44G00651和AT5G17430.1、成员AA2G00186和AT3G20840.1、成员AA44G00309和AT5G10510.3有较近的亲缘关系，同为姊妹关系。组Ⅲ共有7个成员，阿拉伯岩芥成员有3个，拟南芥成员有4个，其中只有成员AA8G00012和AT5G67180.1的亲缘关系最近，可能为亲缘关系较近的一类蛋白。组Ⅳ共有4个成员，阿拉伯岩芥成员数量和拟南芥成员数量相等，都是2个;组Ⅴ只有1个拟南芥成员;组Ⅵ共有2个成员，阿拉伯岩芥和拟南芥成员各1个;组Ⅶ共有4个成员，阿拉伯岩芥成员只有1個，其余均为拟南芥成员，其中拟南芥成员AT2G28550.1是最原始的一支（图7B）。
阿拉伯岩芥AP2基因家族成员AA37G00143与拟南芥等多个物种AP2成员分子进化关系分析表明，阿拉伯岩芥与其他成员都有较高的亲缘关系。其中阿拉伯岩芥成员AA37G00143与拟南芥成员AT1G16060.1和小麦成员Traes-5BL-B6C71B544.1的亲缘关系最近，与印度水稻的亲缘关系最远。从十字花科分类的角度分析，阿拉伯岩芥与拟南芥亲缘关系最近，可能与其同属于十字花科有关，但是与甘蓝的亲缘关系最远;从双子叶植物与单子叶植物分类分析，阿拉伯岩芥亦是与拟南芥和小麦亲缘关系最近，然而与印度水稻的亲缘关系最远，可能与它们分别属于单双子叶植物有关（图8）。
3 讨论与结论
郭慧等[8]对甘蓝AP2/ERF转录因子的研究分析表明甘蓝AP2蛋白质结构为不稳定性蛋白。该研究中阿拉伯岩芥AP2基因编码蛋白之间存在差异性，且为不稳定蛋白，这与郭慧等[8]对甘蓝AP2蛋白结构研究结果相同。谢藤等[72]对新疆紫草AP2/ERF转录因子进行生物信息学分析表明其亚细胞定位存在于细胞核，不存在跨膜域，不属于分泌蛋白。该研究表明阿拉伯岩芥AP2蛋白亚细胞主要存在于细胞核，跨膜域分析显示所有编码蛋白都不属于跨膜蛋白，成员AA8G00350属于分泌蛋白，跨膜域分析与谢藤等[72]的研究结果相同，但亚细胞定位分析和信号肽分析结果与其不同，不同的原因可能与不同物种蛋白的结构组成存在差异性有关。赵金玲等[73]对杨树AP2/ERF基因家族性质的研究表明杨树AP2/ERF家族蛋白二级结构都以随机卷曲为主，其二级结构特点与阿拉伯岩芥AP2基因编码蛋白的二级结构特点相似，都以无规则卷曲结构为主，且阿拉伯岩芥AP2蛋白各个成员的二级结构元件组成含量大小排列顺序都表现为无规则卷曲>α-螺旋>延伸链>β-转角，模拟生成三级结构的图像与二级结构预测的结果相一致。不同物种之间其AP2家族成员数量各有不同，例如拟南芥为30个，玉米为54个，甘蓝为43个。但是不同物种之间的AP2基因具有一定的保守性，都含有特定的AP2结构域[30，71]。该研究显示阿拉伯岩芥AP2基因编码蛋白20个成员都含有AP2保守结构域，其中14个成员有2个保守结构域，其余均只有1个保守结构域。植物为了克服生长发育中不利影响，自身会在体内形成各种应答机制，有些蛋白会在非生物胁迫下作为保护因子调控植物细胞的稳定，进而提升其抗逆性[71，74]。该研究中阿拉伯岩芥AP2蛋白整体成员表现为亲水性蛋白，这可能是利于阿拉伯岩芥增强抗逆性的因素。YRG和RAYD元件都已被证实参与了DNA或其他转录因子的结合。研究证实，AP2中的一个转录因子WXP1与苜蓿和拟南芥的抗旱性都有关[71，75-77]。基因序列对比表明阿拉伯岩芥AP2基因序列含有YRG元件和RAYD元件，推测阿拉伯岩芥抗干旱功能也与其有关。庄静[78]对白菜与拟南芥进行研究分析建构进化树表明，白菜与拟南芥有较近的亲缘关系。该研究中阿拉伯岩芥与多个物种建构系统进化树表明阿拉伯岩芥AP2基因家族与拟南芥、小麦等都有较近的亲缘关系，完善了庄静[78]的系统进化分析结果。
该研究结果表明，阿拉伯岩芥AP2基因家族编码蛋白不同成员之间存在差异，其中只有成员AA40G00375、AA54G00162为稳定蛋白，其余均为不稳定蛋白，其大多数蛋白的亚细胞定位以细胞核为主，只有成员AA8G00350属于分泌蛋白，其余为非分泌蛋白，且所有蛋白为亲水性蛋白，不属于跨膜蛋白，都含有至少1个AP2结构域，通过丝氨酸位点处进行磷酸化来实现功能。其二级结构较整齐，都以无规则卷曲为主，各个成员的二级结构元件组成含量大小排列顺序都表现为无规则卷曲>α-螺旋>延伸链>β-转角，三级结构的图像与二级结构预测的结果相一致。阿拉伯岩芥AP2基因家族与拟南芥、白菜、玉米、小麦等都有较近的亲缘关系，其中阿拉伯岩芥成员AA37G00143与拟南芥成员AT1G16060.1和小麦成员Traes_5BL_B6C71B544.1的亲缘关系最近，与印度水稻的亲缘关系最远。阿拉伯岩芥与拟南芥的亲缘关系最近，可能与其同属于十字花科有关，而与印度水稻的亲缘关系最远，可能与它们分别属于单双子叶植物有关。该研究结果为进一步研究阿拉伯岩芥AP2基因家族在其生长发育过程中的生物学功能提供了一定的参考依据。 参考文献
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