三维黏附培养下获得并分析弥漫性特发性骨质增生症（diffuse idiopathic skeletal hyperostosis, DISH)骨化相关特异性miRNAs。
方法2012年1月至2014年1月通过手术分别获取4份DISH患者骨化黄韧带组织块与4份创伤患者正常黄韧带组织块，采用胶原酶消化法分离组织块中成纤维细胞，在人完全脱细胞羊膜（human acellular amniotic membrane,HAAM）上培养，收获前进行细胞免疫荧光鉴定；提取细胞总RNA并检测其质量，通过YM-100(Millipore）微离心过滤柱得到片段<300 nt的小RNA，采用μParaflo™ miRNA微阵列基因表达实验和分析技术分析miRNAs表达谱，对结果中部分差异miRNAs进行qRT-PCR验证；采用PicTar 2005、miRanda v5、TargetScan 5.1软件预测靶基因；使用Gene Ontology进行靶基因功能注释，基于KEGGPathway数据库分析靶基因所参与的骨化相关信号传导通路；使用TRANSFAC 7.0 public转录因子数据库及Patser预测程序预测转录因子结合位点。
结果成纤维细胞在HAAM上生长时形态保持良好，呈簇状分布，复层生长并建立起细胞间联系；免疫荧光鉴定发现DISH组细胞骨钙素和Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原呈阳性，正常组细胞Ⅰ和Ⅲ型胶原呈阳性；共获得15种信号比值>1.5倍差异表达的miRNAs，12种上调、3种下调，qRT-PCR验证结果与微阵列芯片检测结果一致；共预测出67个靶基因，影响细胞分化、黏附及矿物质沉积等活动，参与MAPK、Wnt、TGF-β、Focal adhesion等多个骨化相关信号途径，预测出10种差异性miRNAs的转录因子。
结论HAAM可实现成纤维细胞在体外三维黏附下生长，部分miRNAs的异常表达可能参与DISH发病。