【摘 要】
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目的 构建含人IL-1受体拮抗蛋白(IL-1 receptor antagonist, IL-1Ra)逆转录病毒表达载体(PLXRN-IL-1Ra),体外转染人骨关节炎(osteoarthritis, OA)软骨细胞,研究其相关特性.方
【机 构】
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上海交通大学医学院附属第九人民医院骨科,中国科学院上海生命科学研究院/上海交通大学医学院健康科学研究所骨科细胞与分子生物学实验室
【基金项目】
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上海市自然科学基金;中国博士后科学基金;上海市博士后科研奖励计划项目
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目的 构建含人IL-1受体拮抗蛋白(IL-1 receptor antagonist, IL-1Ra)逆转录病毒表达载体(PLXRN-IL-1Ra),体外转染人骨关节炎(osteoarthritis, OA)软骨细胞,研究其相关特性.方法 利用细菌内同源重组技术快速构建PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒重组质粒,经测序及酶切鉴定正确后转染PT67细胞,包装成为重组PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒,并使用小鼠肾成纤维细胞系NIH/3T3对病毒进行滴度测定.实验分为3组:未转染组(A组)、PLXRN空质粒转染组(B组)、PLXRN-IL-1Ra转染组(C组),病毒感染人OA软骨细胞后,RT-PCR检测细胞内IL-1Ra基因的转录和表达;ELISA法检测细胞培养上清液中人IL-1Ra蛋白表达.结果 酶切鉴定及基因测序证实重组逆转录病毒质粒中含有人IL-1Ra cDNA,测定包装的病毒滴度为3 × 104 CFU/mL.原代软骨细胞体外培养呈多角形或梭形,甲苯胺蓝染色见细胞内有紫色异染颗粒.RT-PCR结果显示在C组出现311 bp人IL-1Ra mRNA片段,A、B组未见人IL-1Ra mRNA的表达带,GAPDH在各组均有表达.ELISA检测发现C组细胞上清有一定量的人IL-1Ra表达,蛋白浓度为(60.47±15.13)ng/L,A组和B组均无人IL-1Ra表达.结论 构建的IL-1Ra逆转录病毒表达载体成功地感染人OA软骨细胞,并在体外获得稳定表达,为将表达人IL-1Ra基因的人OA软骨细胞用于OA基因治疗提供了实验依据.
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