【摘 要】
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采用 PCR方法 ,将人胰岛素分子 B链 B1 0位 His突变为 Glu,在 B2 4和 B2 5位之间插入 Asp,构建了[B1 0 Glu,B2 4-Asp-B2 5 ]胰岛素原基因 .利用通用型质粒 p BV2 2 0构建表达
【机 构】
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北京大学生命科学学院,北京大学生命科学学院,北京大学生命科学学院,北京大学生命科学学院 蛋白质工程和植物基因工程国家重点实验室,北京100871,蛋白质工程和植物基因工程国家重点实验室,北京10087
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采用 PCR方法 ,将人胰岛素分子 B链 B1 0位 His突变为 Glu,在 B2 4和 B2 5位之间插入 Asp,构建了[B1 0 Glu,B2 4-Asp-B2 5 ]胰岛素原基因 .利用通用型质粒 p BV2 2 0构建表达载体 ,在大肠杆菌 DH5 α中表达 ,表达蛋白为包含体形式 ,约占菌体总蛋白的 2 0 %～ 3 0 % .经过复性和凝胶过滤得到胰岛素原融合蛋白 .用胰蛋白酶和羧肽酶 B酶切 ,经 DEAE离子交换和 RP-HPLC纯化得胰岛素突变体类似物 .用凝胶过滤法测定了蛋白质分子自身的缔合性质 ,用圆二色谱测定了构象变化 .放射性免疫活性及受体结合活性测定结果表明 ,突变体分子缔合性明显下降 ,放免活性和受体结合活性分别约为人胰岛素的 73 .6%和 1 46% .
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