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摘 要：细胞色素P450（CYP450）是动植物及微生物体内一类超基因家族编码的单加氧酶，参与多种催化反应，在生物防御方面具有重要作用。近年来，利用现代生物技术和新一代测序手段及生物信息学分析方法，对参与相关生物代谢合成途径中的CYP450进行了分离、筛选及功能鉴定，进一步阐明了CYP450在植物体内相关代谢途径中的催化机制。本文对植物细胞色素P450（CYP450）基因的分离，在皂苷生物合成、苯丙烷类物质代谢和芥子油苷及IAA生物合成中的功能和表达，以及在人工合成物质的解毒功能及应用等方面的研究做了简要综述。
关键词：细胞色素P450 植物次生代谢 表达调控
Research Process of Cytochrome P450 in Plant
WANG Si-yuan，JIANG Shi-cui，WANG Kang-yu，WANG Yi，ZHANG Mei-ping
（Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）
Abstract：Cytochrome P450s are a diverse array of mixed-function oxidas in animal，plant and bacteria which consist of a gene superfamily.They play an important role in preventing the plants from injury by catalyzing many kinds of reactions.Several candidate CYP450s that might be involved in ginsenoside biosynthesis have been discovered，screening and functional identification by the modern biotechnology and next generation sequencing technology and bioinformatic analysis in previous studies，further elucidate in the relevant CYP450 catalytic mechanism of metanolic pathways in plants.This article summarized gene isolation，function and expression of ginsenoside biosynthesis pathway briefly，phenylpropanoid metabolic pathway and glucosinolates and IAA biosynthesis pathway，and research in the detoxification function and application of synthetic substances.
Key words：Cytochrome P450，Plant secondary metabolism，Expression regulation、
细胞色素P450（cytochrome P450，简称P450）是一类以血红素为辅基的B族细胞色素超家族蛋白酶，是血红素蛋白大家族中极其重要的一员，通常与内质网、线粒体、质体、高尔基体等细胞器膜结合，分布在生命进化过程中的所有分支。之所以命名为P450是因为还原态P450与一氧化碳结合后在450nm处有一吸收峰。因其能插入一个氧原子到疏水性分子而使它们变得更具有活性或者亲水性，所以又被称为单加氧酶（mixed-function oxidase，简称MFO）[1]。最早于1958年在大鼠肝微粒体中被发现。1969年，D.S Frear首次在植物（棉花）中发现了它的存在。至此之后，大量的研究报道表明在包括小麦[2]、蓖麻[3]等许多植物中也均有P450的出现。细胞色素P450作为植物中最大的家族蛋白在植物体内起着重要作用。
随着细胞色素P450的蛋白组成及结构等生化特性日趋明朗，研究学者们逐步将研究方向转移到它所参与的生物体内相关代谢途径和催化反应等方面。那么，利用现代生物技术手段，越来越多的CYP450被成功的克隆分离及外源表达，这大大加快了阐明植物次生代谢途径机制及关键酶基因功能的研究进展。本文就目前CYP450研究的现状，着重对近年来CYP450的分离及其在所参与的生物合成代谢途径中的功能和表达的研究进展进行了综述。
1 植物细胞色素P450的分类
P450基因是一个古老的超基因家族，通常根据基因编码氨基酸序列的相似性及系统进化关系对P450进行分类和命名。在试图确定新发现的P450基因与已知P450基因是否为同一家族时，主要看二者氨基酸序列比对时一致性的比例，若大于40%则它们属于同一个家族，否则属于一个新的家族；若大于40%但小于55%，则它们属于同一家族的两个不同的亚家族；若大于55%，则它们属于同一亚家族。其等位基因氨基酸序列的同源性不小于97%[4]。植物的第一个P450cDNA是CYP71A1，这是1990年由Bozak，K.R.，Yu.H.[5]等在鳄梨中分离的和成熟相关的基因。陆生植物细胞色素P450可分为11个簇（clans），归为2类：单家族簇（CYP51、CYP74、CYP97、CYP710、CYP711、CYP727、CYP746）和多家族簇（CYP71、CYP72、CYP85、CYP86）[6]。研究表明，所有生物细胞色素P450分子之间都具有一定的序列保守性，即细胞色素P450具有不同物种间的同源性，这种同源性表明它们都起源于同一个共同的祖先。那么根据所有已知结构的细胞色素P450基因的特点，将结构中存在保守FxxGxRxCxG序列的血红素结合域（Heme-binding region），作为鉴定P450的主要特征。 2 植物细胞色素P450基因的分离
随着人们对植物基因组研究深度和广度的提高，近年来，研究人员从拟南芥、番茄、水稻、玉米、大豆等主要农作物中分离得到的细胞色素P450基因也日益增多。植物中细胞色素P450基因的数目约占整个基因组基因数目的1%。Nelson[7]等比较分析结果表明：大多数已知的细胞色素P450基因家族，在约2亿年前单子叶植物与双子叶植物分化之前就已经存在了。截至2009年8月，已发布了共11 294条单一细胞色素P450基因（见表1）。综合http：//drnelson.ut mem.edu/Cytoc hrome P450.html所发表的数据。
自发现P450以来，随着研究的深入人们逐步将视线锁定在它的分离及其功能鉴定上，因P450蛋白是原核生物可溶性蛋白中的一种，其化学性质易于分离纯化；而在真核生物中，它往往是通过N-端的疏水序列或者疏水环与线粒体内膜或内质网膜结合，因此很难分离纯化，故人们一直将真核生物P450蛋白的分离作为研究的重点。1991年Durst[8]等发现植物P450蛋白具有以下几个特点：含量低、不稳定、细胞壁不易破碎、水解酶活性及干扰物质含量高，这些特点导致植物P450蛋白的分离异常困难。到目前为止，利用差异筛选法、抗体或探针筛选cDNA文库，序列同源性等方法已成功地分离了数以万计的细胞色素P450基因（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/），部分P450基因功能已得到鉴定[9]。
3 植物P450基因参与的生化途径
植物细胞色素P450具有广泛的催化活性，在植物体内催化多种初级和次级代谢反应，主要用于涉及萜类、生物碱类、甾醇类、脂肪酸、植物激素、信号分子、色素、黄酮类、异黄酮等的合成和代谢反应；以及为了使植物抵抗病虫害和一些非生物胁迫，对部分人工合成的除草剂、杀虫剂等进行修饰，对毒化物质进行降解，从而使植物免受毒害时参与的物质代谢[10，11]。催化作用的共同点是在底物分子中加入一个氧原子。P450蛋白质种类的多样性和底物催化的重叠性，导致催化反应机制广泛而复杂，如在烯基的环氧化反应、烷基的烃化作用、脱烷基作用等10多种作用中有突出体现。正因为CYP450具有多种功能而被人们称为“万能的生物催化剂”。
由于CYP450多样而复杂，赋予不同的P450同工酶具有不同的催化机制、底物特性和反应活性，因此生物对多种物质具有代谢能力。植物细胞色素P450主要参与生物合成和生物解毒两大类功能代谢[12，13]。
3.1 植物细胞色素P450参与的生物合成途径
3.1.1 参与皂苷生物合成的CYP450
三萜皂苷类化合物广泛存在于自然界中，在其生物合成的过程中，植物细胞色素P450主要催化三萜骨架惰性甲基和亚甲基的氧化[14，15]。然而，由于其催化反应的复杂性，因此关于催化机制的研究较少。近年来，随着新一代测序技术的广泛应用，植物基因组及转录组水平的测序分析工作也取得了阶段性进展，筛选出了与皂苷生物合成相关的细胞色素P450，并验证了候选基因的生物学功能， 使皂苷生物合成途径得到了进一步阐明。
2006年Shibuya等[16]从大豆Glycinemax（L.）Merr.中鉴定了第一个参与皂苷元修饰的细胞色素P450酶CYP93E1。
燕麦根皂苷也是一类三萜化合物，分离克隆燕麦根皂苷突变体对阐明燕麦皂苷合成的通路十分必要，Qi等[17]对燕麦根皂苷缺陷突变体Sad2进行了研究，并证明它是一种可催化β-香树脂醇转换为燕麦根皂苷的细胞色素P450酶CYP51H10，可转换为燕麦根皂苷。其表达仅限于根尖表皮。
目前已证实参与甘草中三萜皂苷生物合成的细胞色素P450有CYP88D6、CYP93E3和CYP72A154。与大豆中的CYP93E1一样，CYP93E3催化β-香树脂醇的24位羟基化，而CYP88D6具有β-香树脂醇-11-氧化酶活性，实验表明该酶催化β-香树脂醇经两步氧化反应，先生成11α-羟基-β-香树脂醇，再生成11-羰基-β-香树脂醇[18]。11-羰基-β-香树脂醇是由β-香树脂醇到甘草酸的中间体。而从11-羰基-β-香树脂醇到甘草酸的过程，目前已证明是由CYP72A154催化的3步氧化反应完成的，但目前尚不能完全排除在第2步和第3步氧化中其他酶的参与。在酵母中异源表达结果显示CYP72A154催化11-羰基-β-香树脂醇的C-30位氧化，同时，CYP72A154可能在形成不同结构甘草三萜皂苷元的过程中起到重要作用[19]。组织表达特异性分析显示，CYP88D6在根和匍匐枝中表达，而在叶片和茎中检测不到[18]；CYP72A154除叶片外在根、茎和匍匐枝中均有表达[25]。
Carell等[20]在蒺藜苜蓿中用激活标签法和定向诱导基因组局部突变技术，鉴定了参与溶血皂苷生物合成的CYP716A12，YP716A12 缺陷突变体可以生成大豆皂苷，但却不能产生溶血皂苷。在酵母中异源表达实验证明，催化β-香树脂醇C-28位氧化生成齐墩果酸。同时，实时荧光定量PCR的结果表明，CYP716A12在蒺藜苜蓿不同组织（叶、茎、根）和不同生长阶段（花前期、花期、果期）的表达量为：在花期最高，在果期最低；不同生长期基因在根中的表达水平均较高，且表达量相对稳定；在叶片中，基因表达量在生长期明显增加，在花期达到最高值。
此外，Naoumkina等[21]通过对蒺藜苜蓿基因共表达聚类分析，结果表明CYP93E2参与皂苷的生物合成。鉴于其与同为豆科植物中的β-香树脂醇-24-羟化酶CYP93E1和CYP93E3 的高度同源性，认为CYP93E2也具有β-香树脂醇-24-羟化酶活性，但具体反应尚需实验验证。
在植物体内，CYP450在不同组织中的表达具有特异性，如在皂苷合成较多的根和花中的表达量明显高于其它组织。在三萜皂苷合成代谢途径中，像SS、FPS和DS等基因会响应MeJA 诱导表达量上调，从而使下游细胞色素P450的表达量也随之增加[22]。结合上述两种细胞色素P450的表达特性不难看出，将植物特定组织进行茉莉酸甲酯诱导，筛选与上游基因SS及DS 相似表达模式的CYP450，是从CYP450s家族中筛选参与人参皂苷生物合成的CYP450s的重要手段。 Sun[22]等对西洋参根进行高通量测序和生物信息学分析，用转录组水平最高的CYP450s进行茉莉酸甲酯诱导实验。在根、茎、叶和花4个组织中，仅有属于CYP716家族的contig0024转录本与DS表达模式一致，在系统进化上与拟南芥CYP88家族较近。文章把contig00248转录本作为氧化达玛烷或原人参二醇的关键候选CYP450。
Jung等[23]和Wu等[24]分别选取人参、西洋参不同组织部位实验，经转录组测序和生物信息学分析后得出结论，人参皂苷表达有明显的组织特异性，根中的皂苷含量明显高于其它组织部位。Choi等人[25]采用茉莉酸甲酯处理植物材料，并对因外界刺激而使植物体内人参皂苷合成途径中关键酶表达量升高的CY P450加以探索研究。2011年Han等[26]对人参不定根进行茉莉酸甲酯诱导处理，并进行转录组测序和生物信息学分析，得到分属11个家族的53个CYP450s，其中CYP716A47可诱导表达量上调，将其转入酿酒酵母中，表达的重组蛋白能催化达玛烯二醇-Ⅱ的C-12位羟基化而使其转化为原人参二醇。该报道首次对参与人参皂苷合成的CYP450进行了功能确证。
Luo等[38]对三七根进行高通量测序和生物信息学分析，得到174个CYP450s，从中选出转录组水平较高且可扩增得到全长的15个CYP450s进行聚类分析，结果表明，其中Pn00158 转录本的相关特性与西洋参候选CYP450 contig00248转录本极为相似；有7个CYP450s属于CYP71家族，从系统进化关系角度分析Pn02132转录本与CYP93E1很近。文章认为Pn00158及Pn02132两个转录本很可能是参与人参皂苷合成的候选CYP450。
2012年Han等[28]从茉莉酸甲酯诱导的人参不定根EST文库中克隆到CYP716A53v，将其转入酿酒酵母后表达的重组蛋白能催化原人参二醇的C-6位羟基化而使其转化为原人参三醇。Balusamy等[29]对现有人参EST数据库中全部EST序列进行去除冗余、拼接和注释，将得到的116个预测CYP450s进行聚类分析，结果表明，预测的这些CYP450s分属于22个家族，4个clans；同时结合组织特异性表达模式与茉莉酸甲酯诱导实验结果，用荧光实时定量PCR方法检测不同材料中候选CYP450的表达量，为参与人参皂苷合成途径中的候选CYP450s提供了较全面的功能预测信息。以上关于皂苷合成相关CYP450基因的探索研究，大大促进了皂苷生物合成途径的研究进展，同时为实现皂苷的体外合成提供了重要理论基础。
迄今为止，已命名了5 100个植物细胞色素P450酶（http：//drnelson.uthsc.edu/Cytochrome P450.html）。但关于植物中CYP450基因家族的分类和功能鉴定，仍受到许多因素的限制，包括基因组信息尚不明确，用来进行转录组测序的材料，在选取和质量要求上没有严格标准，皂苷下游合成途径并不完全明晰，很难获得相应的底物和产物等，都将制约CYP450基因的发掘速度。
3.1.2 参与苯丙烷类生物合成的P450基因
苯丙烷途径（图2）是植物特有次生代谢途径，衍生于莽草酸途径，也是植物三大次生代谢途径之一，代谢产物均具有1个由苯丙氨酸合成的C6-C3骨架结构。目前，发现了多种经常出现在苯丙烷类代谢分支途径中关键步骤里的P450，包括C4H、F3’H、F3’5’H、IFS、F2H、FNSⅡ等。催化苯丙烷途径的第2步反应的肉桂酸-4-羟化酶（Cinnamate4-hydroxylase，CHC），它是第一个被鉴定的植物CYP450单加氧酶[30]，也是第一个被克隆并确定功能的植物CYP450，迄今绿豆、菊芋等的CHC基因已被分离[31，32]。CHC对肉桂酸的催化作用具有专一性，相对于其他细胞色素P450最明显的特点是，在植株的各个组织中均具有很高的活性。在某些植物中，它会因为组织的损伤或光照等原因而影响诱导活性；同时，因其处于催化反应的中心位置，且它参与的代谢途径均产生大量的重要代谢物质，如一些植物可通过苯丙烷类代谢产生如木质素、丹宁等重要代谢物，因此得到了广泛的研究。骆萍[33]在研究CYP450参与的棉酚合成过程中，分离得到2个CHC同源cDNA克隆CYP73A25和CYP73A26。经过RT-PCR分析得出，种子中CYP73A25的表达水平很低，而在花瓣、花萼和果皮表达水平则很高；棉花的花瓣、花萼、果皮及发育种子中CYP73A26的表达水平均较高。目前，CHC基因CYP73已被成功克隆和异源表达，并且CY P71～CY P75基因也已成功地在酵母中表达[34]。
苯丙烷类生物合成途径中的一个重要分支是可通过代谢产生异黄酮类物质。类黄酮3’，5’羟化酶（F3’5’H）和类黄酮3’羟化酶（F3’H）分别通过（2S）-柚苷配基的B-环羟化作用和羟化柚皮苷和二氢山奈酚的B-环的3’位置而生成的类黄酮类物质。自1987年以来，学者们利用转基因技术，根据二者在不同物种中的控制位点不同，故在表达中产生花色不同的特点，在F3’5’H和F3’H可修饰花色方面做了大量的工作。
F3’5’H作为第一个被克隆的CYP450基因已从矮牵牛、马鞭草等植物中得到纯化，主要调控花色素等物质的合成。控制其功能的Hf1和Hf2位点使花色表达偏蓝。在植物中，凡缺乏F3’5’H
基因的物种，均不能形成蓝色花。但F3’5’H并不是形成蓝色花色的唯一条件[35]。
现已从拟南芥、矮牵牛中克隆出编码F3’H的cDNA，它在矮牵牛中的表达特性、对花色的决定性和催化特性的研究表
明[36-39]：F3’H在子房、花萼、花梗、茎和花药中均表达，但在花冠伸长时转录水平最高，同时，早期花瓣中F3’H的转录水平高于发育成熟的花。研究人员从葡萄中克隆出4条F3’H序列，但Southern杂交结果表明，F3’H基因家族只有2个成员，其中F3’H1 和F3’H2只在根中微量表达，而F3’H3和F3’H4则在根、茎、叶、花和种子中均有较高水平的表达，因此认为F3’H1、F3’H2和F3’H3、F3’H4分别是两对等位基因。
在苯丙烷类生物合成途径中至少有16个CYP450参与催化反应，其中大多数底物和产物对植物都有毒害作用，因此研究整个代谢途径中CYP450的表达和调控，有助于进一步阐明植物的分类学和进化学关系。
3.1.3 参与芥子油苷和生长素合成的P450基因
近年来，从色氨酸到芥子油苷和生长素的生物合成途径的发现是植物CYP450研究取得的显著进展之一。芥子油苷是由氨基酸衍生的天然产物，当组织受到损伤时，存储在液泡中的芥子油水解为某些腈和硫氰酸等一系列复杂的防御物质，同时，芥子油苷和它的降解产物不仅可以作为抗癌药物用于人体内，并且可作为作物的保护剂应用于农业生产中。此外，生长素作为植物生长的促进剂，在顶端优势、生根、维管组织的分化以及植物的热激行为等方面均具有重要的作用。Bak[41]等研究证明（见图2），生长素和芥子油苷的生物合成具有相同的初始底物，但IAN在生长素生物合成途径中不是IAOx的中间产物。
用酵母筛选[42]证明了拟南芥的CYP79B2和CYP79B3可催化Trp合成芥子油甙的前体物吲哚乙醛肟（IAOx），而IAOx是合成生长素的前体物质。研究人员将CY P79B2基因在拟南芥中异位表达，发现植物矮化、不育等生长素过剩的表型，从而确定CYP79B2参与了Trp合成生长素的反应（如图2）[43]。同时发现在拟南芥中CYP79A1和CYP79A2可分别催化Tyr和Phe，并最终生成芥子油甙。
3.2 参与植物解毒代谢的P450基因
植物在自然条件下生长的过程中，常常受到病、虫、菌等的侵害；以及一些除草剂、杀虫剂和其他化学品的毒害。那么，存在于植物体内的P450就会作为参与除草剂第1阶段解毒过程中的关键酶[44，15]，通过催化作用，在接收到非生物胁迫和外源有机化合物毒害时，进行毒性与非毒性化合物间的转化，以此来抵抗各种外界压力。1969年Frear等研究发现棉花幼苗微粒体中存在能够代谢灭草隆（monuron）的混合功能氧化酶，这直接证明了植物细胞色素P450酶系参与除草剂代谢并具有解毒功能[46]。目前，细胞色素P450参与部分种类除草剂代谢已得到人们广泛的认可，且细胞色素P450在植物体内过量表达，可提高对不同作用机理的除草剂的抗性[47]，随着研究的深入，分离参与除草剂降解的相关基因成了人们研究的热点。
1993年首次从向日葵中得到了具有除草剂抗性的植物P450基因CYP73A1，该基因对绿麦隆（chlorotoluron）有一定的催化代谢作用[48]。Robineau等[49]发现菊芋（Jerusalem artichoke）CYP76B1能代谢除草剂绿麦隆和利谷隆（linuron），在烟草（Nicotiana tabacum）中表达的CYP76B1对绿麦隆和利谷隆的抗性分别增加了10倍和20倍。烟草CYP81B2、CYP71A11[50]和大豆（Gycine max）CYP71A10[51]也能代谢脲类除草剂。在酵母中表达的小麦CYP71C6v1基因，表现出了对氯磺隆（chlorsulfuron）和醚苯磺隆（Triasulfuron）的5-羟基化酶活性，同样也能催化甲磺隆（metsulfuron-methyl）、苄嘧磺隆（bensulfuron methyl）和苯磺隆（tribenuron-methly）代谢为未知化合物[52]。Pang等[53]从水稻中分离到的由Bel基因编码的CYP81A6，研究证实这种新发现的细胞色素P450与水稻抗苯达松（bentazone）和磺酰脲类除草剂有关。2002年Didierjean等[54]以从向日葵中克隆出的CYP76B1和P450还原酶的融合蛋白进行转基因实验的结果显示，单独的CYP76B1对除草剂的代谢能力比融合蛋白转基因高。这意味着融合蛋白表达中蛋白的稳定性下降导致其活性降低。由于除草剂的广泛使用，现已成为生态环境的主要污染源，因此，利用CYP450对除草剂等人工合成物质的代谢研究显得尤为重要。总之，细胞色素CYP450作为与除草剂代谢密切相关的解毒酶，为除草剂的开发应用和培育抗除草剂用的转基因作物打下良好的基础。
4 展望
随着现代生物技术日臻完善，越来越多的植物CYP450被分离，但它仍是该领域研究的重点和难点。其次，到目前为止，已成功分离的上万个CYP450中，只有极少数的基因功能被鉴定。因此以分离植物CYP450基因为前提，验证与测定它们的生物化学功能是目前植物P450研究的焦点。另外，CYP450基因的表达调节主要是转录水平的调节，以及一些生物和非生物因子的调节，如光的诱导、组织器官的特异性和发育分化等因素的影响，因此植物CYP450基因的表达和调控也是今后一段时间的研究热点。对于植物P450基因的研究，无论在理论上探索植物各种合成代谢途径、选择进化，以及与环境的关系，还是在植物基因工程及作物改良中，包括参与创造雄性不育系、培养抗除草剂作物品种等方面都具有广泛而深远的意义，这为生物化学与分子生物学、环境科学、临床医学等领域的发展奠定了基础。
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关键词：细胞色素P450 植物次生代谢 表达调控
Research Process of Cytochrome P450 in Plant
WANG Si-yuan，JIANG Shi-cui，WANG Kang-yu，WANG Yi，ZHANG Mei-ping
（Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）
Abstract：Cytochrome P450s are a diverse array of mixed-function oxidas in animal，plant and bacteria which consist of a gene superfamily.They play an important role in preventing the plants from injury by catalyzing many kinds of reactions.Several candidate CYP450s that might be involved in ginsenoside biosynthesis have been discovered，screening and functional identification by the modern biotechnology and next generation sequencing technology and bioinformatic analysis in previous studies，further elucidate in the relevant CYP450 catalytic mechanism of metanolic pathways in plants.This article summarized gene isolation，function and expression of ginsenoside biosynthesis pathway briefly，phenylpropanoid metabolic pathway and glucosinolates and IAA biosynthesis pathway，and research in the detoxification function and application of synthetic substances.
Key words：Cytochrome P450，Plant secondary metabolism，Expression regulation、
细胞色素P450（cytochrome P450，简称P450）是一类以血红素为辅基的B族细胞色素超家族蛋白酶，是血红素蛋白大家族中极其重要的一员，通常与内质网、线粒体、质体、高尔基体等细胞器膜结合，分布在生命进化过程中的所有分支。之所以命名为P450是因为还原态P450与一氧化碳结合后在450nm处有一吸收峰。因其能插入一个氧原子到疏水性分子而使它们变得更具有活性或者亲水性，所以又被称为单加氧酶（mixed-function oxidase，简称MFO）[1]。最早于1958年在大鼠肝微粒体中被发现。1969年，D.S Frear首次在植物（棉花）中发现了它的存在。至此之后，大量的研究报道表明在包括小麦[2]、蓖麻[3]等许多植物中也均有P450的出现。细胞色素P450作为植物中最大的家族蛋白在植物体内起着重要作用。
随着细胞色素P450的蛋白组成及结构等生化特性日趋明朗，研究学者们逐步将研究方向转移到它所参与的生物体内相关代谢途径和催化反应等方面。那么，利用现代生物技术手段，越来越多的CYP450被成功的克隆分离及外源表达，这大大加快了阐明植物次生代谢途径机制及关键酶基因功能的研究进展。本文就目前CYP450研究的现状，着重对近年来CYP450的分离及其在所参与的生物合成代谢途径中的功能和表达的研究进展进行了综述。
1 植物细胞色素P450的分类
P450基因是一个古老的超基因家族，通常根据基因编码氨基酸序列的相似性及系统进化关系对P450进行分类和命名。在试图确定新发现的P450基因与已知P450基因是否为同一家族时，主要看二者氨基酸序列比对时一致性的比例，若大于40%则它们属于同一个家族，否则属于一个新的家族；若大于40%但小于55%，则它们属于同一家族的两个不同的亚家族；若大于55%，则它们属于同一亚家族。其等位基因氨基酸序列的同源性不小于97%[4]。植物的第一个P450cDNA是CYP71A1，这是1990年由Bozak，K.R.，Yu.H.[5]等在鳄梨中分离的和成熟相关的基因。陆生植物细胞色素P450可分为11个簇（clans），归为2类：单家族簇（CYP51、CYP74、CYP97、CYP710、CYP711、CYP727、CYP746）和多家族簇（CYP71、CYP72、CYP85、CYP86）[6]。研究表明，所有生物细胞色素P450分子之间都具有一定的序列保守性，即细胞色素P450具有不同物种间的同源性，这种同源性表明它们都起源于同一个共同的祖先。那么根据所有已知结构的细胞色素P450基因的特点，将结构中存在保守FxxGxRxCxG序列的血红素结合域（Heme-binding region），作为鉴定P450的主要特征。 2 植物细胞色素P450基因的分离
随着人们对植物基因组研究深度和广度的提高，近年来，研究人员从拟南芥、番茄、水稻、玉米、大豆等主要农作物中分离得到的细胞色素P450基因也日益增多。植物中细胞色素P450基因的数目约占整个基因组基因数目的1%。Nelson[7]等比较分析结果表明：大多数已知的细胞色素P450基因家族，在约2亿年前单子叶植物与双子叶植物分化之前就已经存在了。截至2009年8月，已发布了共11 294条单一细胞色素P450基因（见表1）。综合http：//drnelson.ut mem.edu/Cytoc hrome P450.html所发表的数据。
自发现P450以来，随着研究的深入人们逐步将视线锁定在它的分离及其功能鉴定上，因P450蛋白是原核生物可溶性蛋白中的一种，其化学性质易于分离纯化；而在真核生物中，它往往是通过N-端的疏水序列或者疏水环与线粒体内膜或内质网膜结合，因此很难分离纯化，故人们一直将真核生物P450蛋白的分离作为研究的重点。1991年Durst[8]等发现植物P450蛋白具有以下几个特点：含量低、不稳定、细胞壁不易破碎、水解酶活性及干扰物质含量高，这些特点导致植物P450蛋白的分离异常困难。到目前为止，利用差异筛选法、抗体或探针筛选cDNA文库，序列同源性等方法已成功地分离了数以万计的细胞色素P450基因（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/），部分P450基因功能已得到鉴定[9]。
3 植物P450基因参与的生化途径
植物细胞色素P450具有广泛的催化活性，在植物体内催化多种初级和次级代谢反应，主要用于涉及萜类、生物碱类、甾醇类、脂肪酸、植物激素、信号分子、色素、黄酮类、异黄酮等的合成和代谢反应；以及为了使植物抵抗病虫害和一些非生物胁迫，对部分人工合成的除草剂、杀虫剂等进行修饰，对毒化物质进行降解，从而使植物免受毒害时参与的物质代谢[10，11]。催化作用的共同点是在底物分子中加入一个氧原子。P450蛋白质种类的多样性和底物催化的重叠性，导致催化反应机制广泛而复杂，如在烯基的环氧化反应、烷基的烃化作用、脱烷基作用等10多种作用中有突出体现。正因为CYP450具有多种功能而被人们称为“万能的生物催化剂”。
由于CYP450多样而复杂，赋予不同的P450同工酶具有不同的催化机制、底物特性和反应活性，因此生物对多种物质具有代谢能力。植物细胞色素P450主要参与生物合成和生物解毒两大类功能代谢[12，13]。
3.1 植物细胞色素P450参与的生物合成途径
3.1.1 参与皂苷生物合成的CYP450
三萜皂苷类化合物广泛存在于自然界中，在其生物合成的过程中，植物细胞色素P450主要催化三萜骨架惰性甲基和亚甲基的氧化[14，15]。然而，由于其催化反应的复杂性，因此关于催化机制的研究较少。近年来，随着新一代测序技术的广泛应用，植物基因组及转录组水平的测序分析工作也取得了阶段性进展，筛选出了与皂苷生物合成相关的细胞色素P450，并验证了候选基因的生物学功能， 使皂苷生物合成途径得到了进一步阐明。
2006年Shibuya等[16]从大豆Glycinemax（L.）Merr.中鉴定了第一个参与皂苷元修饰的细胞色素P450酶CYP93E1。
燕麦根皂苷也是一类三萜化合物，分离克隆燕麦根皂苷突变体对阐明燕麦皂苷合成的通路十分必要，Qi等[17]对燕麦根皂苷缺陷突变体Sad2进行了研究，并证明它是一种可催化β-香树脂醇转换为燕麦根皂苷的细胞色素P450酶CYP51H10，可转换为燕麦根皂苷。其表达仅限于根尖表皮。
目前已证实参与甘草中三萜皂苷生物合成的细胞色素P450有CYP88D6、CYP93E3和CYP72A154。与大豆中的CYP93E1一样，CYP93E3催化β-香树脂醇的24位羟基化，而CYP88D6具有β-香树脂醇-11-氧化酶活性，实验表明该酶催化β-香树脂醇经两步氧化反应，先生成11α-羟基-β-香树脂醇，再生成11-羰基-β-香树脂醇[18]。11-羰基-β-香树脂醇是由β-香树脂醇到甘草酸的中间体。而从11-羰基-β-香树脂醇到甘草酸的过程，目前已证明是由CYP72A154催化的3步氧化反应完成的，但目前尚不能完全排除在第2步和第3步氧化中其他酶的参与。在酵母中异源表达结果显示CYP72A154催化11-羰基-β-香树脂醇的C-30位氧化，同时，CYP72A154可能在形成不同结构甘草三萜皂苷元的过程中起到重要作用[19]。组织表达特异性分析显示，CYP88D6在根和匍匐枝中表达，而在叶片和茎中检测不到[18]；CYP72A154除叶片外在根、茎和匍匐枝中均有表达[25]。
Carell等[20]在蒺藜苜蓿中用激活标签法和定向诱导基因组局部突变技术，鉴定了参与溶血皂苷生物合成的CYP716A12，YP716A12 缺陷突变体可以生成大豆皂苷，但却不能产生溶血皂苷。在酵母中异源表达实验证明，催化β-香树脂醇C-28位氧化生成齐墩果酸。同时，实时荧光定量PCR的结果表明，CYP716A12在蒺藜苜蓿不同组织（叶、茎、根）和不同生长阶段（花前期、花期、果期）的表达量为：在花期最高，在果期最低；不同生长期基因在根中的表达水平均较高，且表达量相对稳定；在叶片中，基因表达量在生长期明显增加，在花期达到最高值。
此外，Naoumkina等[21]通过对蒺藜苜蓿基因共表达聚类分析，结果表明CYP93E2参与皂苷的生物合成。鉴于其与同为豆科植物中的β-香树脂醇-24-羟化酶CYP93E1和CYP93E3 的高度同源性，认为CYP93E2也具有β-香树脂醇-24-羟化酶活性，但具体反应尚需实验验证。
在植物体内，CYP450在不同组织中的表达具有特异性，如在皂苷合成较多的根和花中的表达量明显高于其它组织。在三萜皂苷合成代谢途径中，像SS、FPS和DS等基因会响应MeJA 诱导表达量上调，从而使下游细胞色素P450的表达量也随之增加[22]。结合上述两种细胞色素P450的表达特性不难看出，将植物特定组织进行茉莉酸甲酯诱导，筛选与上游基因SS及DS 相似表达模式的CYP450，是从CYP450s家族中筛选参与人参皂苷生物合成的CYP450s的重要手段。 Sun[22]等对西洋参根进行高通量测序和生物信息学分析，用转录组水平最高的CYP450s进行茉莉酸甲酯诱导实验。在根、茎、叶和花4个组织中，仅有属于CYP716家族的contig0024转录本与DS表达模式一致，在系统进化上与拟南芥CYP88家族较近。文章把contig00248转录本作为氧化达玛烷或原人参二醇的关键候选CYP450。
Jung等[23]和Wu等[24]分别选取人参、西洋参不同组织部位实验，经转录组测序和生物信息学分析后得出结论，人参皂苷表达有明显的组织特异性，根中的皂苷含量明显高于其它组织部位。Choi等人[25]采用茉莉酸甲酯处理植物材料，并对因外界刺激而使植物体内人参皂苷合成途径中关键酶表达量升高的CY P450加以探索研究。2011年Han等[26]对人参不定根进行茉莉酸甲酯诱导处理，并进行转录组测序和生物信息学分析，得到分属11个家族的53个CYP450s，其中CYP716A47可诱导表达量上调，将其转入酿酒酵母中，表达的重组蛋白能催化达玛烯二醇-Ⅱ的C-12位羟基化而使其转化为原人参二醇。该报道首次对参与人参皂苷合成的CYP450进行了功能确证。
Luo等[38]对三七根进行高通量测序和生物信息学分析，得到174个CYP450s，从中选出转录组水平较高且可扩增得到全长的15个CYP450s进行聚类分析，结果表明，其中Pn00158 转录本的相关特性与西洋参候选CYP450 contig00248转录本极为相似；有7个CYP450s属于CYP71家族，从系统进化关系角度分析Pn02132转录本与CYP93E1很近。文章认为Pn00158及Pn02132两个转录本很可能是参与人参皂苷合成的候选CYP450。
2012年Han等[28]从茉莉酸甲酯诱导的人参不定根EST文库中克隆到CYP716A53v，将其转入酿酒酵母后表达的重组蛋白能催化原人参二醇的C-6位羟基化而使其转化为原人参三醇。Balusamy等[29]对现有人参EST数据库中全部EST序列进行去除冗余、拼接和注释，将得到的116个预测CYP450s进行聚类分析，结果表明，预测的这些CYP450s分属于22个家族，4个clans；同时结合组织特异性表达模式与茉莉酸甲酯诱导实验结果，用荧光实时定量PCR方法检测不同材料中候选CYP450的表达量，为参与人参皂苷合成途径中的候选CYP450s提供了较全面的功能预测信息。以上关于皂苷合成相关CYP450基因的探索研究，大大促进了皂苷生物合成途径的研究进展，同时为实现皂苷的体外合成提供了重要理论基础。
迄今为止，已命名了5 100个植物细胞色素P450酶（http：//drnelson.uthsc.edu/Cytochrome P450.html）。但关于植物中CYP450基因家族的分类和功能鉴定，仍受到许多因素的限制，包括基因组信息尚不明确，用来进行转录组测序的材料，在选取和质量要求上没有严格标准，皂苷下游合成途径并不完全明晰，很难获得相应的底物和产物等，都将制约CYP450基因的发掘速度。
3.1.2 参与苯丙烷类生物合成的P450基因
苯丙烷途径（图2）是植物特有次生代谢途径，衍生于莽草酸途径，也是植物三大次生代谢途径之一，代谢产物均具有1个由苯丙氨酸合成的C6-C3骨架结构。目前，发现了多种经常出现在苯丙烷类代谢分支途径中关键步骤里的P450，包括C4H、F3’H、F3’5’H、IFS、F2H、FNSⅡ等。催化苯丙烷途径的第2步反应的肉桂酸-4-羟化酶（Cinnamate4-hydroxylase，CHC），它是第一个被鉴定的植物CYP450单加氧酶[30]，也是第一个被克隆并确定功能的植物CYP450，迄今绿豆、菊芋等的CHC基因已被分离[31，32]。CHC对肉桂酸的催化作用具有专一性，相对于其他细胞色素P450最明显的特点是，在植株的各个组织中均具有很高的活性。在某些植物中，它会因为组织的损伤或光照等原因而影响诱导活性；同时，因其处于催化反应的中心位置，且它参与的代谢途径均产生大量的重要代谢物质，如一些植物可通过苯丙烷类代谢产生如木质素、丹宁等重要代谢物，因此得到了广泛的研究。骆萍[33]在研究CYP450参与的棉酚合成过程中，分离得到2个CHC同源cDNA克隆CYP73A25和CYP73A26。经过RT-PCR分析得出，种子中CYP73A25的表达水平很低，而在花瓣、花萼和果皮表达水平则很高；棉花的花瓣、花萼、果皮及发育种子中CYP73A26的表达水平均较高。目前，CHC基因CYP73已被成功克隆和异源表达，并且CY P71～CY P75基因也已成功地在酵母中表达[34]。
苯丙烷类生物合成途径中的一个重要分支是可通过代谢产生异黄酮类物质。类黄酮3’，5’羟化酶（F3’5’H）和类黄酮3’羟化酶（F3’H）分别通过（2S）-柚苷配基的B-环羟化作用和羟化柚皮苷和二氢山奈酚的B-环的3’位置而生成的类黄酮类物质。自1987年以来，学者们利用转基因技术，根据二者在不同物种中的控制位点不同，故在表达中产生花色不同的特点，在F3’5’H和F3’H可修饰花色方面做了大量的工作。
F3’5’H作为第一个被克隆的CYP450基因已从矮牵牛、马鞭草等植物中得到纯化，主要调控花色素等物质的合成。控制其功能的Hf1和Hf2位点使花色表达偏蓝。在植物中，凡缺乏F3’5’H
基因的物种，均不能形成蓝色花。但F3’5’H并不是形成蓝色花色的唯一条件[35]。
现已从拟南芥、矮牵牛中克隆出编码F3’H的cDNA，它在矮牵牛中的表达特性、对花色的决定性和催化特性的研究表
明[36-39]：F3’H在子房、花萼、花梗、茎和花药中均表达，但在花冠伸长时转录水平最高，同时，早期花瓣中F3’H的转录水平高于发育成熟的花。研究人员从葡萄中克隆出4条F3’H序列，但Southern杂交结果表明，F3’H基因家族只有2个成员，其中F3’H1 和F3’H2只在根中微量表达，而F3’H3和F3’H4则在根、茎、叶、花和种子中均有较高水平的表达，因此认为F3’H1、F3’H2和F3’H3、F3’H4分别是两对等位基因。
在苯丙烷类生物合成途径中至少有16个CYP450参与催化反应，其中大多数底物和产物对植物都有毒害作用，因此研究整个代谢途径中CYP450的表达和调控，有助于进一步阐明植物的分类学和进化学关系。
3.1.3 参与芥子油苷和生长素合成的P450基因
近年来，从色氨酸到芥子油苷和生长素的生物合成途径的发现是植物CYP450研究取得的显著进展之一。芥子油苷是由氨基酸衍生的天然产物，当组织受到损伤时，存储在液泡中的芥子油水解为某些腈和硫氰酸等一系列复杂的防御物质，同时，芥子油苷和它的降解产物不仅可以作为抗癌药物用于人体内，并且可作为作物的保护剂应用于农业生产中。此外，生长素作为植物生长的促进剂，在顶端优势、生根、维管组织的分化以及植物的热激行为等方面均具有重要的作用。Bak[41]等研究证明（见图2），生长素和芥子油苷的生物合成具有相同的初始底物，但IAN在生长素生物合成途径中不是IAOx的中间产物。
用酵母筛选[42]证明了拟南芥的CYP79B2和CYP79B3可催化Trp合成芥子油甙的前体物吲哚乙醛肟（IAOx），而IAOx是合成生长素的前体物质。研究人员将CY P79B2基因在拟南芥中异位表达，发现植物矮化、不育等生长素过剩的表型，从而确定CYP79B2参与了Trp合成生长素的反应（如图2）[43]。同时发现在拟南芥中CYP79A1和CYP79A2可分别催化Tyr和Phe，并最终生成芥子油甙。
3.2 参与植物解毒代谢的P450基因
植物在自然条件下生长的过程中，常常受到病、虫、菌等的侵害；以及一些除草剂、杀虫剂和其他化学品的毒害。那么，存在于植物体内的P450就会作为参与除草剂第1阶段解毒过程中的关键酶[44，15]，通过催化作用，在接收到非生物胁迫和外源有机化合物毒害时，进行毒性与非毒性化合物间的转化，以此来抵抗各种外界压力。1969年Frear等研究发现棉花幼苗微粒体中存在能够代谢灭草隆（monuron）的混合功能氧化酶，这直接证明了植物细胞色素P450酶系参与除草剂代谢并具有解毒功能[46]。目前，细胞色素P450参与部分种类除草剂代谢已得到人们广泛的认可，且细胞色素P450在植物体内过量表达，可提高对不同作用机理的除草剂的抗性[47]，随着研究的深入，分离参与除草剂降解的相关基因成了人们研究的热点。
1993年首次从向日葵中得到了具有除草剂抗性的植物P450基因CYP73A1，该基因对绿麦隆（chlorotoluron）有一定的催化代谢作用[48]。Robineau等[49]发现菊芋（Jerusalem artichoke）CYP76B1能代谢除草剂绿麦隆和利谷隆（linuron），在烟草（Nicotiana tabacum）中表达的CYP76B1对绿麦隆和利谷隆的抗性分别增加了10倍和20倍。烟草CYP81B2、CYP71A11[50]和大豆（Gycine max）CYP71A10[51]也能代谢脲类除草剂。在酵母中表达的小麦CYP71C6v1基因，表现出了对氯磺隆（chlorsulfuron）和醚苯磺隆（Triasulfuron）的5-羟基化酶活性，同样也能催化甲磺隆（metsulfuron-methyl）、苄嘧磺隆（bensulfuron methyl）和苯磺隆（tribenuron-methly）代谢为未知化合物[52]。Pang等[53]从水稻中分离到的由Bel基因编码的CYP81A6，研究证实这种新发现的细胞色素P450与水稻抗苯达松（bentazone）和磺酰脲类除草剂有关。2002年Didierjean等[54]以从向日葵中克隆出的CYP76B1和P450还原酶的融合蛋白进行转基因实验的结果显示，单独的CYP76B1对除草剂的代谢能力比融合蛋白转基因高。这意味着融合蛋白表达中蛋白的稳定性下降导致其活性降低。由于除草剂的广泛使用，现已成为生态环境的主要污染源，因此，利用CYP450对除草剂等人工合成物质的代谢研究显得尤为重要。总之，细胞色素CYP450作为与除草剂代谢密切相关的解毒酶，为除草剂的开发应用和培育抗除草剂用的转基因作物打下良好的基础。
4 展望
随着现代生物技术日臻完善，越来越多的植物CYP450被分离，但它仍是该领域研究的重点和难点。其次，到目前为止，已成功分离的上万个CYP450中，只有极少数的基因功能被鉴定。因此以分离植物CYP450基因为前提，验证与测定它们的生物化学功能是目前植物P450研究的焦点。另外，CYP450基因的表达调节主要是转录水平的调节，以及一些生物和非生物因子的调节，如光的诱导、组织器官的特异性和发育分化等因素的影响，因此植物CYP450基因的表达和调控也是今后一段时间的研究热点。对于植物P450基因的研究，无论在理论上探索植物各种合成代谢途径、选择进化，以及与环境的关系，还是在植物基因工程及作物改良中，包括参与创造雄性不育系、培养抗除草剂作物品种等方面都具有广泛而深远的意义，这为生物化学与分子生物学、环境科学、临床医学等领域的发展奠定了基础。
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