【摘 要】
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目的:构建Notch1受体胞内结合域(Notch1 intracellular domain,NICD1)的重组腺病毒AdNICD1,探讨外源性过表达AdNICD1对Notch信号通路激活的影响.方法:利用高保真PCR(high fid
【机 构】
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重庆医科大学附属第一医院骨科,重庆,400016;重庆市第七人民医院内分泌与肾病科,重庆,400054;芝加哥大学医学中心分子肿瘤实验室,伊利诺伊州芝加哥60637,美国
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目的:构建Notch1受体胞内结合域(Notch1 intracellular domain,NICD1)的重组腺病毒AdNICD1,探讨外源性过表达AdNICD1对Notch信号通路激活的影响.方法:利用高保真PCR(high fidelity PCR,Hi-Fi PCR)扩增NICD1编码区,并通过Gibson Assembly方法将其克隆至腺病毒载体中,经过菌落PCR、测序鉴定后,在大肠杆菌BJ51 83中进行同源重组,再次通过质粒PCR鉴定,然后运用PacⅠ酶切线性化后用重组腺病毒载体转染过表达pTP基因的人胚肾293细胞(human embryo kidney 293 cell line,HEK293)中进行包装,收取病毒后使用过表达pTP基因的HEK293细胞扩增重组腺病毒AdNICD1.运用AdNICD1感染脂肪来源的间充质干细胞(immortalized muhipotent adipose-derived mesenchymal stem cells,iMAD),检测病毒感染效率;通过Q-PCR检测NICD1和Notch下游基因表达情况;利用Western blot检测NICD1在蛋白水平的表达情况.结果:成功构建过表达NICD1的重组腺病毒并有效感染iMAD;利用AdNICD1可明显增加NICD1在基因和蛋白水平的表达,并激活Noah信号下游基因的表达.结论:成功构建过表达NICD1的重组腺病毒,并有效激活Notch信号通路.
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