【摘 要】
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目的克隆人血管内皮抑素基因(endostatin),纯化其表达蛋白并初步检测纯化蛋白的生物学活性.方法用PCR技术从正常成人肝cDNA库扩增出人血管内皮抑素基因,将其克隆进pBluescrip
【机 构】
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上海第二医科大学瑞金医院核医学科,上海第二医科大学瑞金医院心血管内科,美国波士顿新英格兰医学中心放射和肿瘤生物学实验室
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目的克隆人血管内皮抑素基因(endostatin),纯化其表达蛋白并初步检测纯化蛋白的生物学活性.方法用PCR技术从正常成人肝cDNA库扩增出人血管内皮抑素基因,将其克隆进pBluescript中测定其核苷酸序列.构建大肠杆菌分泌性表达载体pET-22b(+)-endostatin-6xHis,IPTG诱导表达,经Ni2+-IDA Sepharose 6B亲和纯化该表达蛋白,并采用血管内皮细胞增殖抑制试验检测其活性.结果经PCR扩增成功获得551bp的人血管内皮抑素基因,测序正确,在大肠杆菌中表达后,该表达蛋白的表达量占菌体总蛋白的10%.SDS-PAGE和Western blot显示其分子量为21kd.经亲和纯化后的endostatin-6xHis纯度可达90%,得率为0.3mg/100ml,并且具有抑制血管内皮细胞增殖的活性,达到50%的抑制率需endostatin-6xHis浓度为600ng/ml.结论endostatin基因克隆、表达和纯化的成功,为采用抗血管生成方法治疗裸鼠肿瘤模型和肿瘤病人的研究奠定了基础.
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