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摘要 瘿蚊科是双翅目昆虫中的重要类群。本研究对瘿蚊科3种昆虫—麦红吸浆虫、菊花瘿蚊和食蚜瘿蚊的核糖体DNA进行PCR扩增、克隆、测序及序列分析，并对ITS-1在麦红吸浆虫4个地理种群中的遗传变异情况进行分析。结果表明，从3种昆虫中获得的核糖体DNA序列包括：部分的18S rDNA（44 bp）、28S rDNA（37 bp），全部的ITS-1（487～535 bp），5.8S rDNA（121 bp）及ITS-2（336～352 bp）序列。3种昆虫ITS序列的碱基差异百分比在17.21%～29.59%之间，共含有206个变异位点。ITS-1序列在麦红吸浆虫4个地理种群中比较保守，只有4个变异位点，单倍型多样性为0.311 7～0.796 5，核苷酸多样性为0.000 6～0.002 2。本研究为今后瘿蚊科昆虫的分类鉴定、系统发育和遗传进化等相关研究提供了基础。
关键词 瘿蚊科; 核糖体DNA; 序列分析; 分子鉴定
中图分类号： Q 963
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2019400
Abstract Cecidomyiidae is an important insect group in the order Diptera. The ribosomal DNAs from three gall midges， Sitodiplosis mosellana， Rhopalomyia longicauda and Aphidoletes aphidimyza， were studied by PCR amplification， cloning， sequencing and sequence analysis. The genetic variation of ITS-1 in four geographical populations of S.mosellana was analyzed. The results showed that the rDNA sequences of three insects included partial sequences of 18S rDNA （44 bp） and 28S rDNA （37 bp）， complete sequences of ITS-1 （487-535 bp）， 5.8 S rDNA （121 bp） and ITS-2 （336-352 bp） sequences. The difference among ITS sequences was between 17.21% and 2959%， including a total of 206 variant sites. There was little difference in the ITS-1 sequence among the four geographical populations of S.mosellana， with only 4 variant sites， a haplotype diversity of 0.311 7-0.796 5， and a nucleotide diversity of 0.000 6-0.002 2. This study provides a basis for the study of identification， phylogeny and genetic evolution of gall midges of the Cecidomyiidae family.
Key words Cecidomyiidae; ribosomal DNA; sequence analysis; molecular identification
瘿蚊科Cecidomyiidae隶属于双翅目Diptera，是一类雄虫触角具环毛，翅上显著纵脉不超过5条的蚊类昆虫。由于该科许多种类昆虫的幼虫在植物上形成虫瘿，故通称为瘿蚊[1]。瘿蚊科是具有重要经济意义的一个大科，在世界范围内广泛分布[2]。目前，全球已知的瘿蚊科昆虫有6 590多种，其中包括多种为害农作物、蔬菜、花卉、树木和果树的重要害虫[3]，如麦红吸浆虫Sitodiplosis mosellana、黑森瘿蚊Mayetiola destructor、菊花瘿蚊Rhopalomyia longicauda、刺槐叶瘿蚊Oblodiplosis robiniae和高粱瘿蚊Contarinia sorghicola等，也包括若干捕食蚜蟲、螨类和介壳虫等的天敌昆虫，如食蚜瘿蚊Aphidoletes aphidimyza和Feltiella acarisuga等[4-7]。
目前，瘿蚊科昆虫已成为研究昆虫-寄主之间协同进化的重要材料。传统的瘿蚊科昆虫种类鉴定主要以形态学特征为依据，对于相近种，特别是对于幼虫和卵，利用形态学特征鉴定存在很大的局限性，而以DNA序列为基础的分子鉴定，结果更加准确可靠。目前已开发的瘿蚊科昆虫DNA分子标记还相对较少，且主要集中在线粒体基因的应用上[5，8-10]，而关于核基因序列的相关研究却很少[11]。
内转录间隔区（internal transcribed spacer， ITS）是高度重复的核糖体DNA（rDNA）中介于18S rDNA和28S rDNA之间的内转录间隔区，包括存在于18S rDNA和5.8S rDNA之间的内转录间隔区1（ITS-1）和存在于5.8S rDNA和28S rDNA的内转录间隔区2（ITS-2）两个序列[12-13]。ITS受外界环境因素的影响较小，与编码区域相比具有进化速度慢的特点，在种内具有高度的保守性，在不同种间及亚种间又表现出极大差异[14]。同时，ITS具有大量的拷贝，很容易进行PCR扩增[15]。因此，ITS作为一种重要的分子标记和线粒体DNA信息的补充，在昆虫学的研究中越来越受到重视，并且已被广泛用于昆虫分类学、昆虫分子系统学研究中，在物种鉴定、（种内和近缘种的）亲缘关系和系统发育分析、遗传进化、扩散/传播及昆虫与环境的关系等方面的研究中起着重要的作用[13，15-16]。 本研究采用通用引物对瘿蚊科3种昆虫（麦红吸浆虫、菊花瘿蚊和食蚜瘿蚊）的核糖体DNA序列进行PCR扩增、克隆及序列分析，同时以我国4个地理种群的麦红吸浆虫为研究对象，PCR扩增其ITS-1，并进行序列的变异情况分析。希望本研究能够为今后瘿蚊科昆虫的分类、物种鉴定、亲缘关系和系统发育关系分析等方面的研究提供新的DNA分子标记。
1 材料与方法
1.1 供试昆虫
菊花瘿蚊成虫采自河南省温县，食蚜瘿蚊成虫由衡水田益生防有限责任公司提供，为室内饲養的天敌产品。麦红吸浆虫4个地理种群的样品分别为2012年4月-5月份期间采自河南省辉县、河南省栾川县、宁夏回族自治区银川市和山西省临汾市发生麦红吸浆虫地块的土样。将含有麦红吸浆虫幼虫的土样放于温度（22±1）℃、相对湿度70%～75%，光周期L∥D=14 h∥10 h的条件下让其羽化。收集刚刚羽化的成虫，放于75%乙醇中，-20℃保存备用。
1.2 昆虫基因组DNA（gDNA）的提取
3种昆虫基因组DNA的提取方法参照段云等[17]的方法。提取的总DNA用超纯水溶解后，用0.8%琼脂糖电泳检测DNA的提取效果，然后保存于-20℃备用。
1.3 核糖体DNA的PCR扩增
1.3.1 引物设计与合成
根据GenBank中登录的双翅目昆虫核糖体DNA序列，设计1对用于扩增瘿蚊科昆虫核糖体DNA序列的引物，Cec-F：5′-GTCGTAACAAGGTTTCCGTAG-3′，Cec-R：5′-ATGYAAATTYAGGGGGTAGTC-3′。同时设计合成用于扩增麦红吸浆虫ITS-1基因序列的引物，ITS-1F： 5′-GTCGTAACAAGGTTTCCGTAG-3′，ITS-1R： 5′-GATGTTCATGTGTCCTGCAGT-3′。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。
1.3.2 PCR扩增
以提取的昆虫总DNA为模板进行PCR扩增。其中，扩增麦红吸浆虫ITS序列的样品来自河南辉县。反应总体积为20 μL，包含10×buffer（Mg2 free）2 μL，25 mmol/L Mg2 1.8 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，上游引物（10 pmol/L）1 μL，下游引物（10 pmol/L）1 μL，超纯水10.5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）（大连TaKaRa公司）0.2 μL，含有20～40 ng DNA的模板1.5 μL。PCR反应在SensoQuest LabCycler 2.2型PCR仪上进行，反应程序为：94℃预变性4 min;95℃变性30 s，53℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环;72℃延伸10 min终止反应。
电泳检测：PCR反应结束后，在8 μL PCR反应产物中加入1.6 μL 6×DNA上样缓冲液后，用1.0%琼脂糖电泳进行检测。
1.3.3 PCR产物的纯化、克隆和测序
利用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，回收后的DNA连接到pMDTM19-T载体中，转化大肠杆菌TG1感受态细胞，鉴定阳性转化子后，将菌液送至生工生物工程（上海）有限公司进行测序。
麦红吸浆虫4个地理种群ITS-1的PCR产物，经琼脂糖凝胶电泳检测后，由生工生物工程（上海）有限公司完成PCR产物的纯化及测序。
1.3.4 序列分析
所测序列通过Chromas软件进行读取。在NCBI网站上（www.ncbi.nlm.nih.gov）利用BLAST软件对获得的ITS序列进行同源性比对分析，排除有外源污染的序列，然后将序列提交GenBank，获得GenBank登录号。
利用MEGA 4.0软件[18]对3条ITS序列（ITS-1和ITS-2）进行序列比对分析，并辅以人工校正。然后进行碱基组成、多态位点和遗传距离分析;利用SSR Finder软件（http：∥www.fresnostate.edu/ssrfinder/）对ITS序列进行重复序列的在线查找，查找标准为：单核苷酸重复12次以上，二核苷酸重复6次以上，三核苷酸的重复5次以上，四核苷酸以上的重复4次以上。利用DnaSP v5软件[19]和MEGA 4.0软件对ITS-1在麦红吸浆虫种内的遗传变异情况进行分析，分析内容包括计算核苷酸变异位点（variable sites）、多态性位点（polymorphic sites）、简约信息位点数（parsimony informative polymorphic sites）、单倍型多样性（haplotype diversity）和核苷酸多样性（nucleotide diversity）等。
2 结果与分析
2.1 ITS的PCR扩增、克隆及序列分析
运用扩增瘿蚊科昆虫核糖体DNA的引物（Cec-F和Cec-R）对3种瘿蚊科昆虫的gDNA进行PCR扩增，然后经克隆、测序及序列分析，最终从麦红吸浆虫、菊花瘿蚊和食蚜瘿蚊中各获得一条长度为1 059、1 042 bp和1 073 bp的核DNA序列，其中包含18S rDNA（44 bp）、5.8S rDNA（121 bp）、28S rDNA（37 bp）、ITS-1（487～535 bp）和ITS-2（336～352 bp）的序列。序列比对分析发现，从3种昆虫中扩增出的18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA序列都非常保守，同源性达100%。将这3条序列提交到GenBank，获得GenBank登录号为：MH734104—MH734106。序列的比对分析结果显示，3种昆虫的ITS（ITS1 ITS2）序列长度变化较大，菊花瘿蚊的ITS序列的长度最短，为839 bp，食蚜瘿蚊的ITS序列最长，为871 bp。ITS-1的片段长度在487～535 bp，其中来自菊花瘿蚊的ITS-1序列最短（487 bp），来自食蚜瘿蚊的ITS-1序列最长（535 bp）;ITS-2序列长度在336～352 bp，其中食蚜瘿蚊的ITS-2序列最短（336 bp），菊花瘿蚊的ITS-2序列最长（352 bp）。重复序列查找的结果表明，在麦红吸浆虫的ITS-1序列中含有一个重复序列（AAAT）4，在菊花瘿蚊的ITS-1序列中含有一个重复序列（TTGTG）4，而在食蚜瘿蚊中没有发现重复序列。 對ITS-1序列在麦红吸浆虫4个地理种群中的变异情况的分析结果表明，共发现4个变异位点，并且序列长度比较保守，没有发现碱基的插入或缺失。基于ITS-1序列对我国麦红吸浆虫4个地理种群间的遗传关系的分析结果表明，ITS-1序列的单倍型种类和出现频率在麦红吸浆虫4个地理种群中存在很大的差异。但遗传距离的分析结果显示，4个地理种群间的遗传距离较小，表明种群间虽然存在一定程度的遗传分化，但遗传分化程度较低。Duan等[21]利用SSR标记和线粒体DNA 标记对麦红吸浆虫这4个地理种群的遗传分化研究表明，这4个种群间存在明显的遗传分化。因此，本研究认为ITS-1不适合作为麦红吸浆虫种下遗传分化的分子标记，这与王莉萍等[22]的研究结果表明rDNA-ITS-1序列不适合用于美洲斑潜蝇及其近缘种的种下遗传分化的分子标记的结果类似。
本研究通过对3种瘿蚊科昆虫核糖体DNA的研究及ITS-1在麦红吸浆虫种内的遗传变异情况分析，初步认为ITS序列在瘿蚊科种属间存在较高的变异，可作为瘿蚊科昆虫系统发育研究及分类鉴定的分子标记;ITS-1序列在麦红吸浆虫种内非常保守，遗传变异较小，不适合作为其种内遗传分化的分子标记。到目前为止，有关瘿蚊科昆虫rDNA分子标记的研究报道还很少。希望本研究能够为瘿蚊科昆虫的DNA分子标记开发提供进一步的补充。
参考文献
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（责任编辑：田 喆）
关键词 瘿蚊科; 核糖体DNA; 序列分析; 分子鉴定
中图分类号： Q 963
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2019400
Abstract Cecidomyiidae is an important insect group in the order Diptera. The ribosomal DNAs from three gall midges， Sitodiplosis mosellana， Rhopalomyia longicauda and Aphidoletes aphidimyza， were studied by PCR amplification， cloning， sequencing and sequence analysis. The genetic variation of ITS-1 in four geographical populations of S.mosellana was analyzed. The results showed that the rDNA sequences of three insects included partial sequences of 18S rDNA （44 bp） and 28S rDNA （37 bp）， complete sequences of ITS-1 （487-535 bp）， 5.8 S rDNA （121 bp） and ITS-2 （336-352 bp） sequences. The difference among ITS sequences was between 17.21% and 2959%， including a total of 206 variant sites. There was little difference in the ITS-1 sequence among the four geographical populations of S.mosellana， with only 4 variant sites， a haplotype diversity of 0.311 7-0.796 5， and a nucleotide diversity of 0.000 6-0.002 2. This study provides a basis for the study of identification， phylogeny and genetic evolution of gall midges of the Cecidomyiidae family.
Key words Cecidomyiidae; ribosomal DNA; sequence analysis; molecular identification
瘿蚊科Cecidomyiidae隶属于双翅目Diptera，是一类雄虫触角具环毛，翅上显著纵脉不超过5条的蚊类昆虫。由于该科许多种类昆虫的幼虫在植物上形成虫瘿，故通称为瘿蚊[1]。瘿蚊科是具有重要经济意义的一个大科，在世界范围内广泛分布[2]。目前，全球已知的瘿蚊科昆虫有6 590多种，其中包括多种为害农作物、蔬菜、花卉、树木和果树的重要害虫[3]，如麦红吸浆虫Sitodiplosis mosellana、黑森瘿蚊Mayetiola destructor、菊花瘿蚊Rhopalomyia longicauda、刺槐叶瘿蚊Oblodiplosis robiniae和高粱瘿蚊Contarinia sorghicola等，也包括若干捕食蚜蟲、螨类和介壳虫等的天敌昆虫，如食蚜瘿蚊Aphidoletes aphidimyza和Feltiella acarisuga等[4-7]。
目前，瘿蚊科昆虫已成为研究昆虫-寄主之间协同进化的重要材料。传统的瘿蚊科昆虫种类鉴定主要以形态学特征为依据，对于相近种，特别是对于幼虫和卵，利用形态学特征鉴定存在很大的局限性，而以DNA序列为基础的分子鉴定，结果更加准确可靠。目前已开发的瘿蚊科昆虫DNA分子标记还相对较少，且主要集中在线粒体基因的应用上[5，8-10]，而关于核基因序列的相关研究却很少[11]。
内转录间隔区（internal transcribed spacer， ITS）是高度重复的核糖体DNA（rDNA）中介于18S rDNA和28S rDNA之间的内转录间隔区，包括存在于18S rDNA和5.8S rDNA之间的内转录间隔区1（ITS-1）和存在于5.8S rDNA和28S rDNA的内转录间隔区2（ITS-2）两个序列[12-13]。ITS受外界环境因素的影响较小，与编码区域相比具有进化速度慢的特点，在种内具有高度的保守性，在不同种间及亚种间又表现出极大差异[14]。同时，ITS具有大量的拷贝，很容易进行PCR扩增[15]。因此，ITS作为一种重要的分子标记和线粒体DNA信息的补充，在昆虫学的研究中越来越受到重视，并且已被广泛用于昆虫分类学、昆虫分子系统学研究中，在物种鉴定、（种内和近缘种的）亲缘关系和系统发育分析、遗传进化、扩散/传播及昆虫与环境的关系等方面的研究中起着重要的作用[13，15-16]。 本研究采用通用引物对瘿蚊科3种昆虫（麦红吸浆虫、菊花瘿蚊和食蚜瘿蚊）的核糖体DNA序列进行PCR扩增、克隆及序列分析，同时以我国4个地理种群的麦红吸浆虫为研究对象，PCR扩增其ITS-1，并进行序列的变异情况分析。希望本研究能够为今后瘿蚊科昆虫的分类、物种鉴定、亲缘关系和系统发育关系分析等方面的研究提供新的DNA分子标记。
1 材料与方法
1.1 供试昆虫
菊花瘿蚊成虫采自河南省温县，食蚜瘿蚊成虫由衡水田益生防有限责任公司提供，为室内饲養的天敌产品。麦红吸浆虫4个地理种群的样品分别为2012年4月-5月份期间采自河南省辉县、河南省栾川县、宁夏回族自治区银川市和山西省临汾市发生麦红吸浆虫地块的土样。将含有麦红吸浆虫幼虫的土样放于温度（22±1）℃、相对湿度70%～75%，光周期L∥D=14 h∥10 h的条件下让其羽化。收集刚刚羽化的成虫，放于75%乙醇中，-20℃保存备用。
1.2 昆虫基因组DNA（gDNA）的提取
3种昆虫基因组DNA的提取方法参照段云等[17]的方法。提取的总DNA用超纯水溶解后，用0.8%琼脂糖电泳检测DNA的提取效果，然后保存于-20℃备用。
1.3 核糖体DNA的PCR扩增
1.3.1 引物设计与合成
根据GenBank中登录的双翅目昆虫核糖体DNA序列，设计1对用于扩增瘿蚊科昆虫核糖体DNA序列的引物，Cec-F：5′-GTCGTAACAAGGTTTCCGTAG-3′，Cec-R：5′-ATGYAAATTYAGGGGGTAGTC-3′。同时设计合成用于扩增麦红吸浆虫ITS-1基因序列的引物，ITS-1F： 5′-GTCGTAACAAGGTTTCCGTAG-3′，ITS-1R： 5′-GATGTTCATGTGTCCTGCAGT-3′。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。
1.3.2 PCR扩增
以提取的昆虫总DNA为模板进行PCR扩增。其中，扩增麦红吸浆虫ITS序列的样品来自河南辉县。反应总体积为20 μL，包含10×buffer（Mg2 free）2 μL，25 mmol/L Mg2 1.8 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，上游引物（10 pmol/L）1 μL，下游引物（10 pmol/L）1 μL，超纯水10.5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）（大连TaKaRa公司）0.2 μL，含有20～40 ng DNA的模板1.5 μL。PCR反应在SensoQuest LabCycler 2.2型PCR仪上进行，反应程序为：94℃预变性4 min;95℃变性30 s，53℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环;72℃延伸10 min终止反应。
电泳检测：PCR反应结束后，在8 μL PCR反应产物中加入1.6 μL 6×DNA上样缓冲液后，用1.0%琼脂糖电泳进行检测。
1.3.3 PCR产物的纯化、克隆和测序
利用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，回收后的DNA连接到pMDTM19-T载体中，转化大肠杆菌TG1感受态细胞，鉴定阳性转化子后，将菌液送至生工生物工程（上海）有限公司进行测序。
麦红吸浆虫4个地理种群ITS-1的PCR产物，经琼脂糖凝胶电泳检测后，由生工生物工程（上海）有限公司完成PCR产物的纯化及测序。
1.3.4 序列分析
所测序列通过Chromas软件进行读取。在NCBI网站上（www.ncbi.nlm.nih.gov）利用BLAST软件对获得的ITS序列进行同源性比对分析，排除有外源污染的序列，然后将序列提交GenBank，获得GenBank登录号。
利用MEGA 4.0软件[18]对3条ITS序列（ITS-1和ITS-2）进行序列比对分析，并辅以人工校正。然后进行碱基组成、多态位点和遗传距离分析;利用SSR Finder软件（http：∥www.fresnostate.edu/ssrfinder/）对ITS序列进行重复序列的在线查找，查找标准为：单核苷酸重复12次以上，二核苷酸重复6次以上，三核苷酸的重复5次以上，四核苷酸以上的重复4次以上。利用DnaSP v5软件[19]和MEGA 4.0软件对ITS-1在麦红吸浆虫种内的遗传变异情况进行分析，分析内容包括计算核苷酸变异位点（variable sites）、多态性位点（polymorphic sites）、简约信息位点数（parsimony informative polymorphic sites）、单倍型多样性（haplotype diversity）和核苷酸多样性（nucleotide diversity）等。
2 结果与分析
2.1 ITS的PCR扩增、克隆及序列分析
运用扩增瘿蚊科昆虫核糖体DNA的引物（Cec-F和Cec-R）对3种瘿蚊科昆虫的gDNA进行PCR扩增，然后经克隆、测序及序列分析，最终从麦红吸浆虫、菊花瘿蚊和食蚜瘿蚊中各获得一条长度为1 059、1 042 bp和1 073 bp的核DNA序列，其中包含18S rDNA（44 bp）、5.8S rDNA（121 bp）、28S rDNA（37 bp）、ITS-1（487～535 bp）和ITS-2（336～352 bp）的序列。序列比对分析发现，从3种昆虫中扩增出的18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA序列都非常保守，同源性达100%。将这3条序列提交到GenBank，获得GenBank登录号为：MH734104—MH734106。序列的比对分析结果显示，3种昆虫的ITS（ITS1 ITS2）序列长度变化较大，菊花瘿蚊的ITS序列的长度最短，为839 bp，食蚜瘿蚊的ITS序列最长，为871 bp。ITS-1的片段长度在487～535 bp，其中来自菊花瘿蚊的ITS-1序列最短（487 bp），来自食蚜瘿蚊的ITS-1序列最长（535 bp）;ITS-2序列长度在336～352 bp，其中食蚜瘿蚊的ITS-2序列最短（336 bp），菊花瘿蚊的ITS-2序列最长（352 bp）。重复序列查找的结果表明，在麦红吸浆虫的ITS-1序列中含有一个重复序列（AAAT）4，在菊花瘿蚊的ITS-1序列中含有一个重复序列（TTGTG）4，而在食蚜瘿蚊中没有发现重复序列。 對ITS-1序列在麦红吸浆虫4个地理种群中的变异情况的分析结果表明，共发现4个变异位点，并且序列长度比较保守，没有发现碱基的插入或缺失。基于ITS-1序列对我国麦红吸浆虫4个地理种群间的遗传关系的分析结果表明，ITS-1序列的单倍型种类和出现频率在麦红吸浆虫4个地理种群中存在很大的差异。但遗传距离的分析结果显示，4个地理种群间的遗传距离较小，表明种群间虽然存在一定程度的遗传分化，但遗传分化程度较低。Duan等[21]利用SSR标记和线粒体DNA 标记对麦红吸浆虫这4个地理种群的遗传分化研究表明，这4个种群间存在明显的遗传分化。因此，本研究认为ITS-1不适合作为麦红吸浆虫种下遗传分化的分子标记，这与王莉萍等[22]的研究结果表明rDNA-ITS-1序列不适合用于美洲斑潜蝇及其近缘种的种下遗传分化的分子标记的结果类似。
本研究通过对3种瘿蚊科昆虫核糖体DNA的研究及ITS-1在麦红吸浆虫种内的遗传变异情况分析，初步认为ITS序列在瘿蚊科种属间存在较高的变异，可作为瘿蚊科昆虫系统发育研究及分类鉴定的分子标记;ITS-1序列在麦红吸浆虫种内非常保守，遗传变异较小，不适合作为其种内遗传分化的分子标记。到目前为止，有关瘿蚊科昆虫rDNA分子标记的研究报道还很少。希望本研究能够为瘿蚊科昆虫的DNA分子标记开发提供进一步的补充。
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（责任编辑：田 喆）