论文部分内容阅读
目的
构建时空调控miR-195敲减转基因载体并验证其活性。
方法通过分子克隆技术构建含有神经特异性启动子、四环素诱导表达系统、miR-195海绵、绿色荧光蛋白及绝缘子等调控元件的转基因载体并测序鉴定，利用细胞转染技术将该载体瞬时转染入SH-SY5Y细胞，经荧光显微镜观察其荧光表达，利用实时定量PCR技术及蛋白免疫印迹检测miR-195含量及GFP蛋白表达。
结果通过将Tet-on四环素诱导系统中反义转录激活子rtTA克隆到NSE启动子下游，以及TRE-Tight的多克隆位点内引入miR-195海绵携带IRES介导的EGFP，获得双质粒Tet-on表达载体。以pcDNA3.1＋质粒为骨架，3个不同区域的双拷贝cHs4绝缘子核心片段为间隔，将其调控元件(NSE-rtTA)和反应元件(TRE-miR-195 sponge-IRES-EGFP)串联成单一转基因载体。该载体经测序验证序列正确，瞬时转染入SH-SY5Y细胞，经强力霉素诱导36 h后细胞内可见明显绿色荧光蛋白表达，且miR-195表达水平明显降低。
结论成功构建神经系统特异性miR-195敲减转基因载体，并具有时空调控的特点，为进一步建立转基因动物模型奠定基础。