【摘 要】
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目的 构建人包皮成纤维细胞(HFF)酵母双杂交均一化cDNA文库,为研究弓形虫与宿主细胞间的相互作用及其入侵机制奠定基础. 方法 复苏、培养HFF细胞并提取细胞总RNA,采用SMART和
【机 构】
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山东省医学科学院,山东省寄生虫病防治研究所,山东济宁272033
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目的 构建人包皮成纤维细胞(HFF)酵母双杂交均一化cDNA文库,为研究弓形虫与宿主细胞间的相互作用及其入侵机制奠定基础. 方法 复苏、培养HFF细胞并提取细胞总RNA,采用SMART和LD-PCR合成ds cDNA,对其进行均一化处理后,利用SfiI酶切,酶切后的ds cDNA连接pGADT7-SfiI三阅读框表达载体,连接产物转化至大肠埃希菌HST08,构建cDNA初级文库,进行库容检测和插入片段的PCR鉴定.提取文库质粒转化至酵母Y187中,制备HFF细胞Y187酵母文库. 结果 HFF细胞总RNA的A260/A280值为2.02,1.5％琼脂糖凝胶电泳检测到28S和18S核糖体特异性条带且二者亮度之比为2∶1,提取的RNA完整、质量良好.3种读码框库容分别为1.4×106 CFU/ml、1.8×106 CFU/ml和2.0×106 CFU/ml,重组率为99％.cDNA文库外源基因插入片段长度700～2 000 bp.制备的HFF细胞酵母eDNA文库库容量为2.5×107 CFU/ml. 结论 构建的HFF细胞酵母双杂交cDNA文库具有较高的库容量和重组率,可用于弓形虫蛋白与HFF宿主细胞互作蛋白的筛选.
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