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摘要：通过从耕地土壤中筛选分离野生产漆酶菌株，通过显微及菌落形态观察进行鉴定，并对高产菌株进行定性定量及定性测定，实验结果显示白腐菌具有较好的产酶特性。
关键词：漆酶 白腐菌 性能测定
中图分类号：TQ925 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2013）14-0050-02
食品中漆酶是一种金属糖蛋白，属于多铜氧化酶家族，它分布于动物、植物、真菌、细菌当中，其中最主要的是担子菌亚门的白腐真菌。但由于白腐真菌好氧，生长速度慢，产酶周期长等特点，发酵条件比较苛刻，限制了白腐真菌漆酶的工业化生产和应用。
1 主要原料与试剂
1.1 主要原料
LB固体培养基、改良高氏一号固体培养基、PDA固体培养基、产酶培养基[3]葡萄糖、冰乙酸、乙酸钠、乙醇、氢氧化钠、蛋白胨、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钙均为分析纯。
1.2 仪器设备
高低温恒温振荡培养箱HZQ-F160A型：上海-恒科技有限公司；pH计：pH计上海精密科学仪器有限公司；可见紫外分光光度计：SP-72上海光谱仪器有限公司；显微镜：BA200 Motic；电子天平ALC-2100上海精密仪器仪表有限公司。
2实验方法
2.1 从土壤中筛选分离微生物
从4℃冰箱中取出从长白山、大兴安岭、饶河、伊春、佳木斯等地采集的土壤样品，无菌条件下分别用蒸馏水冲洗后，得到的含菌水。各取1mL于装有9mL生理盐水的试管中，振荡10min，静置5min，即成10-1稀释度的样品溶液。
梯度稀释法分离：取1mL10-1的稀释样品加入装有9mL无菌生理盐水的试管，混匀，即成10-2的稀释溶液，按此法制备10-3的稀释溶液。去每个梯度的稀释溶液各200μL，分别涂于LB固体培养基、改良高氏一号固体培养基和PDA固体培养基平板上，其中LB固体培养基分为：pH3.0、pH7.0、pH10.0，即9个平板，改良高氏一号固体培养基分为：pH5.0、pH8.0、pH12.0即9个平板，PDA固体培养基分为：pH5.0、pH6.0、pH12.0，即9个平板，共计27个平板。于30℃恒温箱培养5天，同时每天做好酶活检测。
待长出菌落后，无菌条件下将形态差异的菌落接种至相应pH的发酵培养基的96深孔板中，于恒温培养箱中30℃培养5天。
2.2 对产漆酶微生物的定性测定
反应体系为1.76mmol/L愈创木酚20μL，酶液50μL。加入50μL酶液，再加入20μL愈创木酚，45℃水浴反应50min，之后恒温箱中100℃静置15min，观察并记录产酶菌生长状况。
2.3 对产漆酶微生物的定量测定
将筛出的产漆酶菌株从对应EP管中接入装有发酵培养基的96深孔板中，30℃恒温培养3天。漆酶活力测定采用愈创木酚的方法，具体方法如下：
配制愈创木酚1.76mmol/L（置于摇床30℃、150rpm，待愈创木酚溶解）、乙酸-乙酸钠缓冲液10m mol/L。对照组接菌液后沸水浴5min以灭活后，加入已配好的乙酸-乙酸钠缓冲液和愈创木酚溶液，与实验组共同水浴反应，反应后沸水浴5min显色并终止反应。
2.4 5菌落形态观察
待所筛选的高产菌株与一株白腐菌分别对应划线接种于LB，改良高氏一号和PDA固体培养基平板上，在30℃恒温培养箱中培养，观察菌落形态及菌丝状态。
3 结果
3.1 产漆酶菌株筛选及分离结果
将从土壤中筛出的244个菌株装于4个96深孔板中，于恒温培养箱中30℃培养5天。选取了其中2个菌株进行了菌落形态分析。PDA-6.0-24：为黑曲霉菌株，菌落密集，菌丝较短；高-10.0-10：为真菌菌株，菌落光滑密集，呈黄色圆形。
3.2 菌株酶活测定结果
3.2.1 产酶微生物的定性分析
将4盒96深孔板中菌株对应接入96孔板中，利用愈创木酚的方法测定其活性。反应体系为1.76mmol/L愈创木酚20μL，酶液50μL，先加酶液，后加愈创木酚，45℃水浴反应50min。利用肉眼辨别96孔板中反应体系颜色变化，变化明显的菌株为产酶活性高的菌株并作记录。
在无菌操作台中，无菌操作程序，利用灭菌后的牙签将所筛选的7株高产菌株从EP管中接入装有相应pH的液体发酵培养基的试管中培养，恒温培养箱中30℃培养3天，待后续的酶活测定分析。
3.2.2 产酶微生物的定量分析
配制愈创木酚1.76mmol/L（置于摇床30℃、150rpm，待愈创木酚溶解）、乙酸-乙酸钠缓冲液10m mol/L。
对照组接菌液后沸水浴5min以灭活后，加入已配好的乙酸-乙酸钠缓冲液和愈创木酚溶液，与实验组共同水浴反应，反应后一同沸水浴5min显色并终止反应。
液体发酵实验显示，在相同条件下，酶活力在不同菌株间有较大差异，其中白腐菌（白）所产漆酶的活力最高，黑曲霉（A4）次之，其余菌株相对较低，由于白腐菌有很高的漆酶分泌能力，故将其作为进一步研究的实验菌。
4 结语
麸皮作碳源、酵母膏作氮源有利于白腐菌漆酶的分泌，pH5.0～5.4的范围内对漆酶的分泌影响差别不大。结果表明：麸皮20g/L、酵母膏5g/L、pH5.0、接种量5%、装液量50mL、温度30℃、摇床转速120rpm是白腐菌产漆酶的最优化条件，第8天达产酶最高峰，峰值酶活为365U/mL为进一步对白腐菌的深入研究奠定了一定理论基础。
参考文献
[1]Huttermann，A.，Mai，C.&Kharazipour，A. Modification of lignin for the production of new compounded materials[J]，Appl Microbiol Biotechnol，2001，55（4）：387-394.
[2]Susana RC，Jose LTH Tndustrial and biotechnological applications of laccases：A review [J].Biotechnology Advances，2006，24：500一513.
[3]黄乾明，谢君.漆酶高产菌株的诱变选育及其产酶条件[J].菌物学报，2006，25（2）：263一272.
关键词：漆酶 白腐菌 性能测定
中图分类号：TQ925 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2013）14-0050-02
食品中漆酶是一种金属糖蛋白，属于多铜氧化酶家族，它分布于动物、植物、真菌、细菌当中，其中最主要的是担子菌亚门的白腐真菌。但由于白腐真菌好氧，生长速度慢，产酶周期长等特点，发酵条件比较苛刻，限制了白腐真菌漆酶的工业化生产和应用。
1 主要原料与试剂
1.1 主要原料
LB固体培养基、改良高氏一号固体培养基、PDA固体培养基、产酶培养基[3]葡萄糖、冰乙酸、乙酸钠、乙醇、氢氧化钠、蛋白胨、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钙均为分析纯。
1.2 仪器设备
高低温恒温振荡培养箱HZQ-F160A型：上海-恒科技有限公司；pH计：pH计上海精密科学仪器有限公司；可见紫外分光光度计：SP-72上海光谱仪器有限公司；显微镜：BA200 Motic；电子天平ALC-2100上海精密仪器仪表有限公司。
2实验方法
2.1 从土壤中筛选分离微生物
从4℃冰箱中取出从长白山、大兴安岭、饶河、伊春、佳木斯等地采集的土壤样品，无菌条件下分别用蒸馏水冲洗后，得到的含菌水。各取1mL于装有9mL生理盐水的试管中，振荡10min，静置5min，即成10-1稀释度的样品溶液。
梯度稀释法分离：取1mL10-1的稀释样品加入装有9mL无菌生理盐水的试管，混匀，即成10-2的稀释溶液，按此法制备10-3的稀释溶液。去每个梯度的稀释溶液各200μL，分别涂于LB固体培养基、改良高氏一号固体培养基和PDA固体培养基平板上，其中LB固体培养基分为：pH3.0、pH7.0、pH10.0，即9个平板，改良高氏一号固体培养基分为：pH5.0、pH8.0、pH12.0即9个平板，PDA固体培养基分为：pH5.0、pH6.0、pH12.0，即9个平板，共计27个平板。于30℃恒温箱培养5天，同时每天做好酶活检测。
待长出菌落后，无菌条件下将形态差异的菌落接种至相应pH的发酵培养基的96深孔板中，于恒温培养箱中30℃培养5天。
2.2 对产漆酶微生物的定性测定
反应体系为1.76mmol/L愈创木酚20μL，酶液50μL。加入50μL酶液，再加入20μL愈创木酚，45℃水浴反应50min，之后恒温箱中100℃静置15min，观察并记录产酶菌生长状况。
2.3 对产漆酶微生物的定量测定
将筛出的产漆酶菌株从对应EP管中接入装有发酵培养基的96深孔板中，30℃恒温培养3天。漆酶活力测定采用愈创木酚的方法，具体方法如下：
配制愈创木酚1.76mmol/L（置于摇床30℃、150rpm，待愈创木酚溶解）、乙酸-乙酸钠缓冲液10m mol/L。对照组接菌液后沸水浴5min以灭活后，加入已配好的乙酸-乙酸钠缓冲液和愈创木酚溶液，与实验组共同水浴反应，反应后沸水浴5min显色并终止反应。
2.4 5菌落形态观察
待所筛选的高产菌株与一株白腐菌分别对应划线接种于LB，改良高氏一号和PDA固体培养基平板上，在30℃恒温培养箱中培养，观察菌落形态及菌丝状态。
3 结果
3.1 产漆酶菌株筛选及分离结果
将从土壤中筛出的244个菌株装于4个96深孔板中，于恒温培养箱中30℃培养5天。选取了其中2个菌株进行了菌落形态分析。PDA-6.0-24：为黑曲霉菌株，菌落密集，菌丝较短；高-10.0-10：为真菌菌株，菌落光滑密集，呈黄色圆形。
3.2 菌株酶活测定结果
3.2.1 产酶微生物的定性分析
将4盒96深孔板中菌株对应接入96孔板中，利用愈创木酚的方法测定其活性。反应体系为1.76mmol/L愈创木酚20μL，酶液50μL，先加酶液，后加愈创木酚，45℃水浴反应50min。利用肉眼辨别96孔板中反应体系颜色变化，变化明显的菌株为产酶活性高的菌株并作记录。
在无菌操作台中，无菌操作程序，利用灭菌后的牙签将所筛选的7株高产菌株从EP管中接入装有相应pH的液体发酵培养基的试管中培养，恒温培养箱中30℃培养3天，待后续的酶活测定分析。
3.2.2 产酶微生物的定量分析
配制愈创木酚1.76mmol/L（置于摇床30℃、150rpm，待愈创木酚溶解）、乙酸-乙酸钠缓冲液10m mol/L。
对照组接菌液后沸水浴5min以灭活后，加入已配好的乙酸-乙酸钠缓冲液和愈创木酚溶液，与实验组共同水浴反应，反应后一同沸水浴5min显色并终止反应。
液体发酵实验显示，在相同条件下，酶活力在不同菌株间有较大差异，其中白腐菌（白）所产漆酶的活力最高，黑曲霉（A4）次之，其余菌株相对较低，由于白腐菌有很高的漆酶分泌能力，故将其作为进一步研究的实验菌。
4 结语
麸皮作碳源、酵母膏作氮源有利于白腐菌漆酶的分泌，pH5.0～5.4的范围内对漆酶的分泌影响差别不大。结果表明：麸皮20g/L、酵母膏5g/L、pH5.0、接种量5%、装液量50mL、温度30℃、摇床转速120rpm是白腐菌产漆酶的最优化条件，第8天达产酶最高峰，峰值酶活为365U/mL为进一步对白腐菌的深入研究奠定了一定理论基础。
参考文献
[1]Huttermann，A.，Mai，C.&Kharazipour，A. Modification of lignin for the production of new compounded materials[J]，Appl Microbiol Biotechnol，2001，55（4）：387-394.
[2]Susana RC，Jose LTH Tndustrial and biotechnological applications of laccases：A review [J].Biotechnology Advances，2006，24：500一513.
[3]黄乾明，谢君.漆酶高产菌株的诱变选育及其产酶条件[J].菌物学报，2006，25（2）：263一272.